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Les vecteurs de gènes pour le traitement de la mucoviscidose pulmonaire doivent être ciblés sur les voies respiratoires conductrices, car la transduction pulmonaire périphérique n'a aucun effet thérapeutique.L'efficacité de la transduction virale est directement liée au temps de séjour du porteur.Cependant, les fluides d'administration tels que les porteurs de gènes diffusent naturellement dans les alvéoles lors de l'inhalation, et les particules thérapeutiques de toute forme sont rapidement éliminées par transport mucociliaire.Prolonger le temps de séjour des porteurs de gènes dans les voies respiratoires est important mais difficile à réaliser.Les particules magnétiques porteuses conjuguées qui peuvent être dirigées vers la surface des voies respiratoires peuvent améliorer le ciblage régional.En raison de problèmes d'imagerie in vivo, le comportement de ces petites particules magnétiques sur la surface des voies respiratoires en présence d'un champ magnétique appliqué est mal compris.Le but de cette étude était d'utiliser l'imagerie synchrotron pour visualiser in vivo le mouvement d'une série de particules magnétiques dans la trachée de rats anesthésiés afin d'étudier la dynamique et les modèles de comportement des particules simples et en vrac in vivo.Nous avons ensuite également évalué si la livraison de particules magnétiques lentivirales en présence d'un champ magnétique augmenterait l'efficacité de la transduction dans la trachée du rat.L'imagerie par rayons X synchrotron montre le comportement des particules magnétiques dans des champs magnétiques fixes et mobiles in vitro et in vivo.Les particules ne peuvent pas être facilement traînées sur la surface des voies respiratoires vivantes à l'aide d'aimants, mais pendant le transport, les dépôts sont concentrés dans le champ de vision, où le champ magnétique est le plus fort.L'efficacité de la transduction a également été multipliée par six lorsque des particules magnétiques lentivirales ont été délivrées en présence d'un champ magnétique.Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les particules magnétiques lentivirales et les champs magnétiques peuvent être des approches utiles pour améliorer le ciblage des vecteurs de gènes et les niveaux de transduction dans les voies respiratoires conductrices in vivo.
La fibrose kystique (CF) est causée par des variations dans un seul gène appelé le régulateur de conductance transmembranaire CF (CFTR).La protéine CFTR est un canal ionique présent dans de nombreuses cellules épithéliales de l'organisme, y compris les voies respiratoires, site majeur de la pathogenèse de la mucoviscidose.Les défauts du CFTR entraînent un transport anormal de l'eau, une déshydratation de la surface des voies respiratoires et une diminution de la profondeur de la couche de fluide de surface des voies respiratoires (ASL).Il altère également la capacité du système de transport mucociliaire (MCT) à dégager les voies respiratoires des particules inhalées et des agents pathogènes.Notre objectif est de développer une thérapie génique lentivirale (LV) pour délivrer la bonne copie du gène CFTR et améliorer la santé ASL, MCT et pulmonaire, et de continuer à développer de nouvelles technologies capables de mesurer ces paramètres in vivo1.
Les vecteurs LV sont l'un des principaux candidats pour la thérapie génique de la mucoviscidose, principalement parce qu'ils peuvent intégrer de manière permanente le gène thérapeutique dans les cellules basales des voies respiratoires (cellules souches des voies respiratoires).Ceci est important car ils peuvent restaurer une hydratation et une clairance du mucus normales en se différenciant en cellules de surface des voies respiratoires fonctionnelles corrigées par les gènes associées à la fibrose kystique, ce qui entraîne des avantages tout au long de la vie.Les vecteurs VG doivent être dirigés contre les voies respiratoires conductrices, car c'est là que commence l'atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose.La livraison du vecteur plus profondément dans le poumon peut entraîner une transduction alvéolaire, mais cela n'a aucun effet thérapeutique dans la mucoviscidose.Cependant, les fluides tels que les porteurs de gènes migrent naturellement dans les alvéoles lorsqu'ils sont inhalés après l'accouchement3,4 et les particules thérapeutiques sont rapidement expulsées dans la cavité buccale par les MCT.L'efficacité de la transduction LV est directement liée à la durée pendant laquelle le vecteur reste proche des cellules cibles pour permettre l'absorption cellulaire - "temps de résidence" 5 qui est facilement raccourci par le flux d'air régional typique ainsi que l'absorption coordonnée de mucus et de particules MCT.Pour la fibrose kystique, la capacité à prolonger le temps de séjour du VG dans les voies respiratoires est importante pour atteindre des niveaux élevés de transduction dans cette zone, mais a jusqu'à présent été difficile.
Pour surmonter cet obstacle, nous proposons que les particules magnétiques LV (MP) puissent aider de deux manières complémentaires.Premièrement, ils peuvent être guidés par un aimant vers la surface des voies respiratoires pour améliorer le ciblage et aider les particules porteuses de gènes à se trouver dans la bonne zone des voies respiratoires ;et ASL) se déplacent dans la couche cellulaire 6. Les députés sont largement utilisés comme véhicules d'administration de médicaments ciblés lorsqu'ils se lient à des anticorps, des médicaments de chimiothérapie ou d'autres petites molécules qui se fixent aux membranes cellulaires ou se lient à leurs récepteurs de surface cellulaire respectifs et s'accumulent aux sites tumoraux dans présence d'électricité statique.Champs magnétiques pour le traitement du cancer 7. D'autres méthodes « hyperthermiques » visent à tuer les cellules tumorales en chauffant les MP lorsqu'elles sont exposées à des champs magnétiques oscillants.Le principe de la transfection magnétique, dans lequel un champ magnétique est utilisé comme agent de transfection pour améliorer le transfert d'ADN dans les cellules, est couramment utilisé in vitro en utilisant une gamme de vecteurs de gènes non viraux et viraux pour les lignées cellulaires difficiles à transduire ..L'efficacité de la magnétotransfection LV avec la délivrance de LV MP in vitro dans une lignée cellulaire d'épithélium bronchique humain en présence d'un champ magnétique statique a été établie, augmentant l'efficacité de la transduction de 186 fois par rapport au vecteur LV seul.LV MT a également été appliqué à un modèle in vitro de mucoviscidose, où la transfection magnétique a augmenté la transduction du VG dans les cultures d'interface air-liquide d'un facteur 20 en présence d'expectorations de mucoviscidose10.Cependant, la magnétotransfection d'organes in vivo a reçu relativement peu d'attention et n'a été évaluée que dans quelques études animales11,12,13,14,15, en particulier dans les poumons16,17.Cependant, les possibilités de transfection magnétique en thérapie pulmonaire dans la mucoviscidose sont claires.Tan et al.(2020) ont déclaré qu'"une étude de validation sur l'administration pulmonaire efficace de nanoparticules magnétiques ouvrira la voie à de futures stratégies d'inhalation de CFTR pour améliorer les résultats cliniques chez les patients atteints de mucoviscidose"6.
Le comportement des petites particules magnétiques à la surface des voies respiratoires en présence d'un champ magnétique appliqué est difficile à visualiser et à étudier, et donc mal compris.Dans d'autres études, nous avons développé une méthode d'imagerie par rayons X à contraste de phase basée sur la propagation synchrotron (PB-PCXI) pour l'imagerie non invasive et la quantification des changements in vivo in vivo de la profondeur ASL18 et du comportement MCT19,20 pour mesurer directement l'hydratation de la surface du canal gazeux. et est utilisé comme indicateur précoce de l'efficacité du traitement.De plus, notre méthode de notation MCT utilise des particules de 10 à 35 µm de diamètre composées d'alumine ou de verre à indice de réfraction élevé comme marqueurs MCT visibles avec PB-PCXI21.Les deux méthodes conviennent à l'imagerie d'une gamme de types de particules, y compris les députés.
En raison de la résolution spatiale et temporelle élevée, nos tests ASL et MCT basés sur PB-PCXI sont bien adaptés pour étudier la dynamique et les modèles de comportement des particules simples et en vrac in vivo pour nous aider à comprendre et à optimiser les méthodes de livraison des gènes MP.L'approche que nous utilisons ici est basée sur nos études utilisant la ligne de lumière SPring-8 BL20B2, dans laquelle nous avons visualisé le mouvement des fluides après l'administration d'une dose d'un vecteur factice dans les voies respiratoires nasales et pulmonaires de souris pour aider à expliquer nos modèles d'expression génique hétérogènes observés dans notre gène.études animales avec une dose porteuse de 3,4 .
Le but de cette étude était d'utiliser le synchrotron PB-PCXI pour visualiser les mouvements in vivo d'une série de MPs dans la trachée de rats vivants.Ces études d'imagerie PB-PCXI ont été conçues pour tester la série MP, l'intensité du champ magnétique et l'emplacement afin de déterminer leur effet sur le mouvement MP.Nous avons supposé qu'un champ magnétique externe aiderait le MF délivré à rester ou à se déplacer vers la zone cible.Ces études nous ont également permis de déterminer des configurations d'aimants qui maximisent la quantité de particules laissées dans la trachée après le dépôt.Dans une deuxième série d'études, nous avons cherché à utiliser cette configuration optimale pour démontrer le schéma de transduction résultant de l'administration in vivo de LV-MP aux voies respiratoires du rat, en supposant que l'administration de LV-MP dans le cadre du ciblage des voies respiratoires entraînerait dans l'augmentation de l'efficacité de la transduction du VG..
Toutes les études animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés par l'Université d'Adélaïde (M-2019-060 et M-2020-022) et le SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Les expériences ont été réalisées conformément aux recommandations de l'ARRIVE.
Toutes les images aux rayons X ont été prises sur la ligne de lumière BL20XU du synchrotron SPring-8 au Japon en utilisant une configuration similaire à celle décrite précédemment21,22.Brièvement, le caisson expérimental était situé à 245 m de l'anneau de stockage du synchrotron.Une distance échantillon-détecteur de 0,6 m est utilisée pour les études d'imagerie des particules et de 0,3 m pour les études d'imagerie in vivo afin de créer des effets de contraste de phase.Un faisceau monochromatique d'une énergie de 25 keV a été utilisé.Les images ont été acquises à l'aide d'un transducteur de rayons X haute résolution (SPring-8 BM3) couplé à un détecteur sCMOS.Le transducteur convertit les rayons X en lumière visible à l'aide d'un scintillateur de 10 µm d'épaisseur (Gd3Al2Ga3O12), qui est ensuite dirigé vers le capteur sCMOS à l'aide d'un objectif de microscope ×10 (NA 0,3).Le détecteur sCMOS était un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japon) avec une taille de matrice de 2048 × 2048 pixels et une taille de pixel brut de 6,5 × 6,5 µm.Ce paramètre donne une taille de pixel isotrope effective de 0,51 µm et un champ de vision d'environ 1,1 mm × 1,1 mm.La durée d'exposition de 100 ms a été choisie pour maximiser le rapport signal sur bruit des particules magnétiques à l'intérieur et à l'extérieur des voies respiratoires tout en minimisant les artefacts de mouvement causés par la respiration.Pour les études in vivo, un obturateur à rayons X rapide a été placé dans le trajet des rayons X pour limiter la dose de rayonnement en bloquant le faisceau de rayons X entre les expositions.
Le support LV n'a été utilisé dans aucune étude d'imagerie SPring-8 PB-PCXI, car la chambre d'imagerie BL20XU n'est pas certifiée Biosafety Level 2.Au lieu de cela, nous avons sélectionné une gamme de MP bien caractérisés auprès de deux fournisseurs commerciaux couvrant une gamme de tailles, de matériaux, de concentrations de fer et d'applications, d'abord afin de comprendre comment les champs magnétiques affectent le mouvement des MP dans les capillaires en verre, puis dans voies respiratoires vivantes.surface.La taille du MP varie de 0,25 à 18 µm et est constituée de divers matériaux (voir tableau 1), mais la composition de chaque échantillon, y compris la taille des particules magnétiques dans le MP, est inconnue.Sur la base de nos études MCT approfondies 19, 20, 21, 23, 24, nous nous attendons à ce que les MP jusqu'à 5 µm puissent être vus sur la surface des voies respiratoires trachéales, par exemple, en soustrayant des images consécutives pour voir une meilleure visibilité du mouvement MP.Un seul MP ​​de 0,25 µm est inférieur à la résolution du dispositif d'imagerie, mais le PB-PCXI devrait détecter leur contraste volumétrique et le mouvement du liquide de surface sur lequel ils sont déposés après avoir été déposés.
Échantillons pour chaque PM du tableau.1 a été préparé dans des capillaires en verre de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) avec un diamètre interne de 0,63 mm.Les particules corpusculaires sont disponibles dans l'eau, tandis que les particules CombiMag sont disponibles dans le liquide exclusif du fabricant.Chaque tube est rempli à moitié de liquide (environ 11 µl) et placé sur le porte-échantillon (voir Figure 1).Les capillaires en verre ont été placés horizontalement sur la scène dans la chambre d'imagerie, respectivement, et positionnés aux bords du liquide.Un aimant à coque en nickel de 19 mm de diamètre (28 mm de long) composé de terres rares, de néodyme, de fer et de bore (NdFeB) (N35, n° de cat. LM1652, Jaycar Electronics, Australie) avec une rémanence de 1,17 T a été fixé à un table de transfert séparée pour réaliser Changez à distance votre position pendant le rendu.L'imagerie par rayons X commence lorsque l'aimant est positionné à environ 30 mm au-dessus de l'échantillon et les images sont acquises à 4 images par seconde.Pendant l'imagerie, l'aimant a été rapproché du tube capillaire en verre (à une distance d'environ 1 mm) puis déplacé le long du tube pour évaluer l'effet de l'intensité du champ et de la position.
Une configuration d'imagerie in vitro contenant des échantillons MP dans des capillaires en verre au stade de la traduction de l'échantillon xy.Le trajet du faisceau de rayons X est marqué d'une ligne pointillée rouge.
Une fois la visibilité in vitro des MP établie, un sous-ensemble d'entre eux a été testé in vivo sur des rats Wistar albinos femelles de type sauvage (~12 semaines, ~200 g).Médétomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japon), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japon) et butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Les rats ont été anesthésiés avec le mélange Pharma (Japon) par injection intrapéritonéale.Après l'anesthésie, ils ont été préparés pour l'imagerie en enlevant la fourrure autour de la trachée, en insérant un tube endotrachéal (ET; canule intraveineuse 16 Ga, Terumo BCT) et en les immobilisant en position couchée sur une plaque d'imagerie sur mesure contenant un sac thermique pour maintenir la température corporelle.22. La plaque d'imagerie a ensuite été fixée à la platine de l'échantillon dans la boîte d'imagerie à un léger angle pour aligner la trachée horizontalement sur l'image radiographique, comme illustré à la figure 2a.
(a) Configuration d'imagerie in vivo dans l'unité d'imagerie SPring-8, trajet du faisceau de rayons X marqué d'une ligne pointillée rouge.( b, c ) La localisation de l'aimant trachéal a été effectuée à distance à l'aide de deux caméras IP montées orthogonalement.Sur le côté gauche de l'image à l'écran, vous pouvez voir la boucle de fil tenant la tête et la canule de livraison installée à l'intérieur du tube ET.
Un système de pompe à seringue télécommandé (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) utilisant une seringue en verre de 100 µl a été connecté à un tube PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) à l'aide d'une aiguille de 30 Ga.Marquer le tube pour s'assurer que la pointe est dans la bonne position dans la trachée lors de l'insertion du tube endotrachéal.À l'aide d'une micropompe, le piston de la seringue a été retiré et l'extrémité du tube a été immergée dans l'échantillon MP à délivrer.Le tube de livraison chargé a ensuite été inséré dans le tube endotrachéal, plaçant la pointe à la partie la plus forte de notre champ magnétique appliqué attendu.L'acquisition d'images a été contrôlée à l'aide d'un détecteur de souffle connecté à notre boîtier de synchronisation basé sur Arduino, et tous les signaux (par exemple, température, respiration, ouverture/fermeture de l'obturateur et acquisition d'images) ont été enregistrés à l'aide de Powerlab et LabChart (AD Instruments, Sydney, Australie) 22 Lors de l'imagerie Lorsque le boîtier n'était pas disponible, deux caméras IP (Panasonic BB-SC382) étaient positionnées à environ 90° l'une de l'autre et utilisées pour contrôler la position de l'aimant par rapport à la trachée pendant l'imagerie (Figure 2b, c).Pour minimiser les artéfacts de mouvement, une image par respiration a été acquise pendant le plateau de débit respiratoire terminal.
L'aimant est fixé au deuxième étage, qui peut être situé à distance à l'extérieur du corps d'imagerie.Diverses positions et configurations de l'aimant ont été testées, notamment : placé à un angle d'environ 30 ° au-dessus de la trachée (les configurations sont illustrées sur les figures 2a et 3a) ;un aimant au-dessus de l'animal et l'autre en dessous, avec les pôles d'attraction (Figure 3b)., un aimant au-dessus de l'animal et un en dessous, avec les pôles fixés pour la répulsion (figure 3c), et un aimant au-dessus et perpendiculaire à la trachée (figure 3d).Après avoir mis en place l'animal et l'aimant et chargé le MP à tester dans la pompe à seringue, administrer une dose de 50 µl à un débit de 4 µl/sec lors de l'acquisition des images.L'aimant est ensuite déplacé d'avant en arrière le long ou à travers la trachée tout en continuant à acquérir des images.
Configuration de l'aimant pour l'imagerie in vivo (a) un aimant au-dessus de la trachée à un angle d'environ 30°, (b) deux aimants configurés pour l'attraction, (c) deux aimants configurés pour la répulsion, (d) un aimant au-dessus et perpendiculaire à la trachée.L'observateur a regardé de la bouche aux poumons à travers la trachée et le faisceau de rayons X a traversé le côté gauche du rat et est sorti du côté droit.L'aimant est soit déplacé le long des voies respiratoires, soit à gauche et à droite au-dessus de la trachée dans la direction du faisceau de rayons X.
Nous avons également cherché à déterminer la visibilité et le comportement des particules dans les voies respiratoires en l'absence de mélange de la respiration et du rythme cardiaque.Par conséquent, à la fin de la période d'imagerie, les animaux ont été euthanasiés sans cruauté en raison d'une surdose de pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, États-Unis ; ~ 65 mg/kg ip).Certains animaux ont été laissés sur la plate-forme d'imagerie, et après l'arrêt de la respiration et du rythme cardiaque, le processus d'imagerie a été répété, en ajoutant une dose supplémentaire de MP si aucun MP n'était visible sur la surface des voies respiratoires.
Les images résultantes ont été corrigées pour le champ plat et sombre, puis assemblées en un film (20 images par seconde ; 15 à 25 × vitesse normale en fonction de la fréquence respiratoire) à l'aide d'un script personnalisé écrit en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Toutes les études sur la livraison du vecteur du gène LV ont été menées au Centre de recherche sur les animaux de laboratoire de l'Université d'Adélaïde et visaient à utiliser les résultats de l'expérience SPring-8 pour évaluer si la livraison du LV-MP en présence d'un champ magnétique pouvait améliorer le transfert de gène in vivo. .Pour évaluer les effets du MF et du champ magnétique, deux groupes d'animaux ont été traités : un groupe a reçu une injection de LV MF avec placement d'aimant, et l'autre groupe a reçu une injection d'un groupe témoin de LV MF sans aimant.
vecteurs de gènes LV ont été générés en utilisant des méthodes décrites précédemment 25, 26 .Le vecteur LacZ exprime un gène de bêta-galactosidase localisé au niveau nucléaire piloté par le promoteur constitutif du MPSV (LV-LacZ), qui produit un produit de réaction bleu dans les cellules transduites, visible sur les fronts et les coupes de tissu pulmonaire.Le titrage a été effectué dans des cultures cellulaires en comptant manuellement le nombre de cellules LacZ-positives à l'aide d'un hémocytomètre pour calculer le titre en TU/ml.Les supports sont cryoconservés à -80°C, décongelés avant utilisation et liés au CombiMag par mélange 1:1 et incubés sur de la glace pendant au moins 30 minutes avant la livraison.
Rats Sprague Dawley normaux (n = 3/groupe, ~2-3 anesthésiés ip avec un mélange de 0,4 mg/kg de médétomidine (Domitor, Ilium, Australie) et 60 mg/kg de kétamine (Ilium, Australie) à l'âge de 1 mois) ip ) injection et canulation orale non chirurgicale avec une canule intraveineuse de 16 Ga.Pour s'assurer que le tissu des voies respiratoires trachéales reçoit la transduction VG, il a été conditionné à l'aide de notre protocole de perturbation mécanique décrit précédemment dans lequel la surface des voies respiratoires trachéales a été frottée axialement avec un panier métallique (N-Circle, extracteur de calculs en nitinol sans pointe NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, États-Unis) 30 p28.Puis, environ 10 minutes après la perturbation dans l'enceinte de sécurité biologique, l'administration trachéale de LV-MP a été effectuée.
Le champ magnétique utilisé dans cette expérience a été configuré de manière similaire à une étude aux rayons X in vivo, avec les mêmes aimants maintenus sur la trachée avec des pinces de stent de distillation (Figure 4).Un volume de 50 µl (aliquotes de 2 x 25 µl) de LV-MP a été délivré à la trachée (n = 3 animaux) à l'aide d'une pipette à pointe de gel comme décrit précédemment.Le groupe témoin (n = 3 animaux) a reçu le même LV-MP sans l'utilisation d'un aimant.Une fois la perfusion terminée, la canule est retirée du tube endotrachéal et l'animal est extubé.L'aimant reste en place pendant 10 minutes avant d'être retiré.Des rats ont reçu une dose sous-cutanée de méloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australie) suivi d'un retrait de l'anesthésie par injection intrapéritonéale de 1 mg/kg de chlorhydrate d'atipamazole (Antisedan, Zoetis, Australie).Les rats ont été maintenus au chaud et observés jusqu'à la récupération complète de l'anesthésie.
Dispositif de livraison LV-MP dans une enceinte de sécurité biologique.Vous pouvez voir que le manchon Luer-lock gris clair du tube ET dépasse de la bouche et que la pointe de la pipette de gel illustrée sur la figure est insérée dans le tube ET à la profondeur souhaitée dans la trachée.
Une semaine après la procédure d'administration de LV-MP, les animaux ont été sacrifiés sans cruauté par inhalation de CO2 à 100 % et l'expression de LacZ a été évaluée à l'aide de notre traitement X-gal standard.Les trois anneaux de cartilage les plus caudaux ont été retirés pour s'assurer que tout dommage mécanique ou rétention de liquide dû au placement du tube endotrachéal ne serait pas inclus dans l'analyse.Chaque trachée a été coupée dans le sens de la longueur pour obtenir deux moitiés pour analyse et placée dans une coupelle contenant du caoutchouc de silicone (Sylgard, Dow Inc) à l'aide d'une aiguille Minutien (Fine Science Tools) pour visualiser la surface luminale.La distribution et le caractère des cellules transduites ont été confirmés par photographie frontale à l'aide d'un microscope Nikon (SMZ1500) avec un appareil photo DigiLite et le logiciel TCapture (Tucsen Photonics, Chine).Les images ont été acquises à un grossissement de 20x (y compris le réglage maximal pour toute la largeur de la trachée), avec toute la longueur de la trachée affichée étape par étape, offrant suffisamment de chevauchement entre chaque image pour permettre aux images d'être "cousues".Les images de chaque trachée ont ensuite été combinées en une seule image composite à l'aide de Composite Image Editor version 2.0.3 (Microsoft Research) en utilisant l'algorithme de mouvement planaire. La zone d'expression de LacZ dans les images composites trachéales de chaque animal a été quantifiée à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment28, en utilisant des paramètres de 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 et Value < 0,7. La zone d'expression de LacZ dans les images composites trachéales de chaque animal a été quantifiée à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment28, en utilisant des paramètres de 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 et Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,sept. La zone d'expression de LacZ dans les images trachéales composites de chaque animal a été quantifiée à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment28 en utilisant des paramètres de 0,350,15 et valeur<0,7.如 前所 述 ， 使用 自动 Matlab 脚本 （R2020A ， MathWorks） 对 来自 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 LACZ 表达 区域 进行 量化 ， 使用 0,35 <色调 <0,58 、 饱和度> 0,15 和值 <0,7 的。。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（R2020A ， MathWorks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 .................... HANCHE Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Les zones d'expression de LacZ sur des images composites de la trachée de chaque animal ont été quantifiées à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment en utilisant des paramètres de 0,35 < teinte < 0,58, saturation > 0,15 et valeur < 0,7 .En suivant les contours des tissus dans GIMP v2.10.24, un masque a été créé manuellement pour chaque image composite afin d'identifier la zone de tissu et d'éviter toute fausse détection en dehors du tissu trachéal.Les zones colorées de toutes les images composites de chaque animal ont été additionnées pour donner la zone colorée totale pour cet animal.La surface peinte a ensuite été divisée par la surface totale du masque pour obtenir une surface normalisée.
Chaque trachée a été incluse dans de la paraffine et sectionnée à 5 µm d'épaisseur.Les sections ont été contre-colorées avec du rouge rapide neutre pendant 5 minutes et les images ont été acquises à l'aide d'un microscope Nikon Eclipse E400, d'une caméra DS-Fi3 et d'un logiciel de capture d'éléments NIS (version 5.20.00).
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).La signification statistique a été fixée à p ≤ 0,05.La normalité a été testée à l'aide du test de Shapiro-Wilk et les différences de coloration LacZ ont été évaluées à l'aide d'un test t non apparié.
Les six MP décrites dans le tableau 1 ont été examinées par PCXI, et la visibilité est décrite dans le tableau 2. Deux MP de polystyrène (MP1 et MP2 ; 18 µm et 0,25 µm, respectivement) n'étaient pas visibles par PCXI, mais les échantillons restants ont pu être identifiés (des exemples sont illustrés à la figure 5).MP3 et MP4 sont faiblement visibles (10-15 % Fe3O4 ; 0,25 µm et 0,9 µm, respectivement).Bien que le MP5 (98 % Fe3O4 ; 0,25 µm) contienne certaines des plus petites particules testées, il était le plus prononcé.Le produit CombiMag MP6 est difficile à distinguer.Dans tous les cas, notre capacité à détecter les MF a été grandement améliorée en déplaçant l'aimant d'avant en arrière parallèlement au capillaire.Au fur et à mesure que les aimants s'éloignaient du capillaire, les particules étaient extraites en longues chaînes, mais à mesure que les aimants se rapprochaient et que l'intensité du champ magnétique augmentait, les chaînes de particules se raccourcissaient à mesure que les particules migraient vers la surface supérieure du capillaire (voir la vidéo supplémentaire S1 : MP4), augmentant la densité de particules en surface.Inversement, lorsque l'aimant est retiré du capillaire, l'intensité du champ diminue et les MP se réorganisent en longues chaînes s'étendant de la surface supérieure du capillaire (voir la vidéo supplémentaire S2 : MP4).Une fois que l'aimant a cessé de bouger, les particules continuent de bouger pendant un certain temps après avoir atteint la position d'équilibre.Lorsque le MP se rapproche et s'éloigne de la surface supérieure du capillaire, les particules magnétiques ont tendance à attirer les débris à travers le liquide.
La visibilité de MP sous PCXI varie considérablement d'un échantillon à l'autre.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6.Toutes les images présentées ici ont été prises avec un aimant positionné à environ 10 mm directement au-dessus du capillaire.Les grands cercles apparents sont des bulles d'air piégées dans les capillaires, montrant clairement les caractéristiques de bord noir et blanc de l'image en contraste de phase.La case rouge indique le grossissement qui améliore le contraste.Notez que les diamètres des circuits magnétiques dans toutes les figures ne sont pas à l'échelle et sont environ 100 fois plus grands que ceux indiqués.
Lorsque l'aimant se déplace de gauche à droite le long du haut du capillaire, l'angle de la chaîne MP change pour s'aligner avec l'aimant (voir Figure 6), délimitant ainsi les lignes de champ magnétique.Pour MP3-5, une fois que la corde atteint l'angle de seuil, les particules traînent le long de la surface supérieure du capillaire.Il en résulte souvent que les MP se regroupent en groupes plus importants près de l'endroit où le champ magnétique est le plus fort (voir la vidéo supplémentaire S3 : MP5).Ceci est également particulièrement évident lors de l'imagerie à proximité de l'extrémité du capillaire, ce qui provoque l'agrégation et la concentration du MP à l'interface liquide-air.Les particules du MP6, plus difficiles à distinguer que celles du MP3-5, n'ont pas traîné lorsque l'aimant s'est déplacé le long du capillaire, mais les cordes MP se sont dissociées, laissant les particules en vue (voir la vidéo supplémentaire S4 : MP6).Dans certains cas, lorsque le champ magnétique appliqué était réduit en déplaçant l'aimant sur une longue distance du site d'imagerie, tous les MP restants descendaient lentement vers la surface inférieure du tube par gravité, restant dans la chaîne (voir la vidéo supplémentaire S5 : MP3) .
L'angle de la chaîne MP change lorsque l'aimant se déplace vers la droite au-dessus du capillaire.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6.La case rouge indique le grossissement qui améliore le contraste.Veuillez noter que les vidéos supplémentaires sont à titre informatif car elles révèlent une structure particulaire importante et des informations dynamiques qui ne peuvent pas être visualisées dans ces images statiques.
Nos tests ont montré que déplacer l'aimant d'avant en arrière lentement le long de la trachée facilite la visualisation du MF dans le contexte de mouvement complexe in vivo.Aucun test in vivo n'a été réalisé car les billes de polystyrène (MP1 et MP2) n'étaient pas visibles dans le capillaire.Chacun des quatre MF restants a été testé in vivo avec l'axe long de l'aimant positionné au-dessus de la trachée à un angle d'environ 30° par rapport à la verticale (voir les figures 2b et 3a), car cela entraînait des chaînes MF plus longues et était plus efficace qu'un aimant..configuration terminée.MP3, MP4 et MP6 n'ont été trouvés dans la trachée d'aucun animal vivant.Lors de la visualisation des voies respiratoires des rats après avoir tué les animaux sans cruauté, les particules sont restées invisibles même lorsqu'un volume supplémentaire a été ajouté à l'aide d'une pompe à seringue.Le MP5 avait la teneur en oxyde de fer la plus élevée et était la seule particule visible, il a donc été utilisé pour évaluer et caractériser le comportement du MP in vivo.
Le placement de l'aimant sur la trachée lors de l'insertion du MF a entraîné la concentration de nombreux MF, mais pas tous, dans le champ de vision.L'entrée trachéale des particules est mieux observée chez les animaux euthanasiés sans cruauté.Figure 7 et vidéo supplémentaire S6 : MP5 montre une capture magnétique rapide et un alignement des particules à la surface de la trachée ventrale, indiquant que les députés peuvent être ciblés sur les zones souhaitées de la trachée.Lors d'une recherche plus distale le long de la trachée après l'administration du MF, certains MF ont été trouvés plus près de la carène, ce qui indique une intensité de champ magnétique insuffisante pour collecter et retenir tous les MF, car ils ont été délivrés dans la région d'intensité maximale du champ magnétique lors de l'administration de fluide.traiter.Cependant, les concentrations de MP postnatales étaient plus élevées autour de la zone d'image, ce qui suggère que de nombreux MP sont restés dans les régions des voies respiratoires où l'intensité du champ magnétique appliqué était la plus élevée.
Images de (a) avant et (b) après l'administration de MP5 dans la trachée d'un rat récemment euthanasié avec un aimant placé juste au-dessus de la zone d'imagerie.La zone représentée est située entre deux anneaux cartilagineux.Il y a du liquide dans les voies respiratoires avant que le MP ne soit délivré.La case rouge indique le grossissement qui améliore le contraste.Ces images sont extraites de la vidéo présentée dans S6 : MP5 Supplementary Video.
Le déplacement de l'aimant le long de la trachée in vivo a entraîné une modification de l'angle de la chaîne MP à la surface des voies respiratoires, similaire à celle observée dans les capillaires (voir la figure 8 et la vidéo supplémentaire S7 : MP5).Cependant, dans notre étude, les MP ne pouvaient pas être entraînés à la surface des voies respiratoires vivantes, comme le pouvaient les capillaires.Dans certains cas, la chaîne MP s'allonge lorsque l'aimant se déplace de gauche à droite.Fait intéressant, nous avons également constaté que la chaîne de particules modifie la profondeur de la couche superficielle du fluide lorsque l'aimant est déplacé longitudinalement le long de la trachée et se dilate lorsque l'aimant est déplacé directement au-dessus de la tête et que la chaîne de particules est tournée vers une position verticale (voir Vidéo supplémentaire S7).: MP5 à 0:09, en bas à droite).Le modèle de mouvement caractéristique a changé lorsque l'aimant a été déplacé latéralement à travers le haut de la trachée (c'est-à-dire vers la gauche ou la droite de l'animal, plutôt que le long de la trachée).Les particules étaient encore clairement visibles pendant leur mouvement, mais lorsque l'aimant a été retiré de la trachée, les pointes des chaînes de particules sont devenues visibles (voir la vidéo supplémentaire S8 : MP5, à partir de 0:08).Ceci est en accord avec le comportement observé du champ magnétique sous l'action d'un champ magnétique appliqué dans un capillaire en verre.
Exemples d'images montrant MP5 dans la trachée d'un rat anesthésié vivant.(a) L'aimant est utilisé pour acquérir des images au-dessus et à gauche de la trachée, puis (b) après avoir déplacé l'aimant vers la droite.La case rouge indique le grossissement qui améliore le contraste.Ces images proviennent de la vidéo présentée dans la vidéo supplémentaire de S7 : MP5.
Lorsque les deux pôles étaient accordés dans une orientation nord-sud au-dessus et au-dessous de la trachée (c'est-à-dire attirant ; Fig. 3b), les cordes MP apparaissaient plus longues et étaient situées sur la paroi latérale de la trachée plutôt que sur la surface dorsale de la trachée. trachée (voir annexe).Vidéo S9 :MP5).Cependant, des concentrations élevées de particules sur un site (c'est-à-dire la surface dorsale de la trachée) n'ont pas été détectées après l'administration de liquide à l'aide d'un dispositif à double aimant, ce qui se produit généralement avec un dispositif à un seul aimant.Ensuite, lorsqu'un aimant a été configuré pour repousser les pôles opposés (figure 3c), le nombre de particules visibles dans le champ de vision n'a pas augmenté après la livraison.La configuration des deux configurations d'aimants est difficile en raison de l'intensité élevée du champ magnétique qui attire ou pousse les aimants respectivement.La configuration a ensuite été changée en un seul aimant parallèle aux voies respiratoires mais traversant les voies respiratoires à un angle de 90 degrés de sorte que les lignes de force traversent la paroi trachéale orthogonalement (Figure 3d), une orientation destinée à déterminer la possibilité d'agrégation de particules sur la paroi latérale.être observé.Cependant, dans cette configuration, il n'y avait pas de mouvement d'accumulation de MF ou de mouvement d'aimant identifiable.Sur la base de tous ces résultats, une configuration avec un seul aimant et une orientation à 30 degrés a été choisie pour les études in vivo des porteurs de gènes (Fig. 3a).
Lorsque l'animal a été imagé plusieurs fois immédiatement après avoir été sacrifié sans cruauté, l'absence de mouvement des tissus gênants signifiait que des lignes de particules plus fines et plus courtes pouvaient être discernées dans le champ intercartilagineux clair, "se balançant" conformément au mouvement de translation de l'aimant.voir clairement la présence et le mouvement des particules MP6.
Le titre de LV-LacZ était de 1,8 x 108 UI/mL, et après mélange 1:1 avec CombiMag MP (MP6), les animaux ont reçu une injection de 50 µl d'une dose trachéale de 9 x 107 UI/ml de véhicule LV (soit 4,5 x 106 UT/rat).).).Dans ces études, au lieu de déplacer l'aimant pendant le travail, nous avons fixé l'aimant dans une position pour déterminer si la transduction VG pouvait (a) être améliorée par rapport à l'administration vectorielle en l'absence de champ magnétique, et (b) si les voies respiratoires pouvaient concentre-toi.Les cellules étant transduites dans les zones cibles magnétiques des voies respiratoires supérieures.
La présence d'aimants et l'utilisation de CombiMag en combinaison avec des vecteurs LV ne semblaient pas nuire à la santé animale, comme l'a fait notre protocole standard de livraison de vecteurs LV.Les images frontales de la région trachéale soumise à une perturbation mécanique (Fig. 1 supplémentaire) ont montré que le groupe traité par LV-MP présentait des niveaux de transduction significativement plus élevés en présence d'un aimant (Fig. 9a).Seule une petite quantité de coloration bleue LacZ était présente dans le groupe témoin (figure 9b).La quantification des régions normalisées colorées par X-Gal a montré que l'administration de LV-MP en présence d'un champ magnétique entraînait une amélioration d'environ 6 fois (Fig. 9c).
Exemple d'images composites montrant la transduction trachéale avec LV-MP (a) en présence d'un champ magnétique et (b) en l'absence d'aimant.( c ) Amélioration statistiquement significative de la zone normalisée de transduction LacZ dans la trachée avec l'utilisation d'un aimant (* p = 0, 029, test t, n = 3 par groupe, moyenne ± erreur standard de la moyenne).
Des sections colorées en rouge rapide neutre (exemple illustré dans la Fig. 2 supplémentaire) ont indiqué que des cellules colorées par LacZ étaient présentes dans le même échantillon et au même emplacement que celui indiqué précédemment.
Le principal défi de la thérapie génique des voies respiratoires reste la localisation précise des particules porteuses dans les zones d'intérêt et l'obtention d'un haut niveau d'efficacité de transduction dans le poumon mobile en présence d'un flux d'air et d'une clairance active du mucus.Pour les porteurs LV destinés au traitement des maladies respiratoires dans la mucoviscidose, l'augmentation du temps de séjour des particules porteuses dans les voies respiratoires conductrices était jusqu'à présent un objectif inaccessible.Comme l'ont souligné Castellani et al., l'utilisation de champs magnétiques pour améliorer la transduction présente des avantages par rapport à d'autres méthodes de livraison de gènes telles que l'électroporation, car elle peut combiner simplicité, économie, livraison localisée, efficacité accrue et temps d'incubation plus court.et éventuellement une dose plus faible de véhicule10.Cependant, le dépôt in vivo et le comportement des particules magnétiques dans les voies respiratoires sous l'influence de forces magnétiques externes n'ont jamais été décrits, et en fait la capacité de cette méthode à augmenter les niveaux d'expression génique dans les voies respiratoires vivantes intactes n'a pas été démontrée in vivo.
Nos expériences in vitro sur le synchrotron PCXI ont montré que toutes les particules que nous avons testées, à l'exception du polystyrène MP, étaient visibles dans la configuration d'imagerie que nous avons utilisée.En présence d'un champ magnétique, les champs magnétiques forment des chaînes dont la longueur est liée au type de particules et à la force du champ magnétique (c'est-à-dire la proximité et le mouvement de l'aimant).Comme le montre la figure 10, les chaînes que nous observons se forment lorsque chaque particule individuelle devient magnétisée et induit son propre champ magnétique local.Ces champs séparés provoquent la collecte et la connexion d'autres particules similaires avec des mouvements de cordes de groupe dus aux forces locales des forces locales d'attraction et de répulsion d'autres particules.
Schéma montrant (a, b) des chaînes de particules se formant à l'intérieur de capillaires remplis de liquide et (c, d) une trachée remplie d'air.Notez que les capillaires et la trachée ne sont pas dessinés à l'échelle.Le panneau (a) contient également une description du MF contenant des particules de Fe3O4 disposées en chaînes.
Lorsque l'aimant s'est déplacé sur le capillaire, l'angle de la chaîne de particules a atteint le seuil critique pour MP3-5 contenant Fe3O4, après quoi la chaîne de particules n'est plus restée dans sa position d'origine, mais s'est déplacée le long de la surface vers une nouvelle position.aimant.Cet effet se produit probablement parce que la surface du capillaire en verre est suffisamment lisse pour permettre à ce mouvement de se produire.Fait intéressant, MP6 (CombiMag) ne s'est pas comporté de cette façon, peut-être parce que les particules étaient plus petites, avaient un revêtement ou une charge de surface différente, ou que le fluide porteur exclusif affectait leur capacité à se déplacer.Le contraste dans l'image des particules CombiMag est également plus faible, ce qui suggère que le liquide et les particules peuvent avoir la même densité et ne peuvent donc pas facilement se déplacer l'un vers l'autre.Les particules peuvent également rester bloquées si l'aimant se déplace trop rapidement, ce qui indique que l'intensité du champ magnétique ne peut pas toujours surmonter le frottement entre les particules dans le fluide, ce qui suggère que l'intensité du champ magnétique et la distance entre l'aimant et la zone cible ne doivent pas venir comme un surprendre.important.Ces résultats indiquent également que bien que les aimants puissent capturer de nombreuses microparticules traversant la zone cible, il est peu probable que l'on puisse compter sur les aimants pour déplacer les particules CombiMag le long de la surface de la trachée.Ainsi, nous avons conclu que les études in vivo LV MF devraient utiliser des champs magnétiques statiques pour cibler physiquement des zones spécifiques de l'arbre des voies respiratoires.
Une fois que les particules sont délivrées dans le corps, elles sont difficiles à identifier dans le contexte du tissu complexe en mouvement du corps, mais leur capacité de détection a été améliorée en déplaçant l'aimant horizontalement sur la trachée pour "agiter" les cordes MP.Bien que l'imagerie en temps réel soit possible, il est plus facile de discerner le mouvement des particules après que l'animal a été tué sans cruauté.Les concentrations de MP étaient généralement les plus élevées à cet endroit lorsque l'aimant était positionné au-dessus de la zone d'imagerie, bien que certaines particules soient généralement trouvées plus bas dans la trachée.Contrairement aux études in vitro, les particules ne peuvent pas être entraînées dans la trachée par le mouvement d'un aimant.Cette découverte est cohérente avec la façon dont le mucus qui recouvre la surface de la trachée traite généralement les particules inhalées, les piégeant dans le mucus et les éliminant ensuite par le mécanisme de clairance muco-ciliaire.
Nous avons émis l'hypothèse que l'utilisation d'aimants au-dessus et au-dessous de la trachée pour l'attraction (Fig. 3b) pourrait entraîner un champ magnétique plus uniforme, plutôt qu'un champ magnétique hautement concentré en un point, entraînant potentiellement une distribution plus uniforme des particules..Cependant, notre étude préliminaire n'a pas trouvé de preuves claires pour étayer cette hypothèse.De même, le réglage d'une paire d'aimants pour repousser (Fig. 3c) n'a pas entraîné plus de sédimentation de particules dans la zone d'image.Ces deux résultats démontrent que la configuration à double aimant n'améliore pas de manière significative le contrôle local du pointage MP et que les forces magnétiques fortes qui en résultent sont difficiles à régler, ce qui rend cette approche moins pratique.De même, l'orientation de l'aimant au-dessus et à travers la trachée (figure 3d) n'a pas non plus augmenté le nombre de particules restant dans la zone imagée.Certaines de ces configurations alternatives peuvent ne pas réussir car elles entraînent une réduction de l'intensité du champ magnétique dans la zone de dépôt.Ainsi, la configuration à aimant unique à 30 degrés (Fig. 3a) est considérée comme la méthode de test in vivo la plus simple et la plus efficace.
L'étude LV-MP a montré que lorsque les vecteurs LV étaient combinés avec CombiMag et délivrés après avoir été physiquement perturbés en présence d'un champ magnétique, les niveaux de transduction augmentaient de manière significative dans la trachée par rapport aux témoins.Sur la base d'études d'imagerie synchrotron et des résultats de LacZ, le champ magnétique semble être capable de maintenir le LV dans la trachée et de réduire le nombre de particules vectorielles qui pénètrent immédiatement profondément dans les poumons.De telles améliorations de ciblage peuvent conduire à une plus grande efficacité tout en réduisant les titres délivrés, la transduction non ciblée, les effets secondaires inflammatoires et immunitaires et les coûts de transfert de gènes.Surtout, selon le fabricant, CombiMag peut être utilisé en combinaison avec d'autres méthodes de transfert de gènes, y compris d'autres vecteurs viraux (tels que l'AAV) et des acides nucléiques.