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Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire qui module le microenvironnement de l'hôte infecté et est connu pour être associé à l'incidence de la croissance des tumeurs cérébrales.Dans cette étude, nous émettons l'hypothèse que le miARN-21 exosomal d'une infection à Toxoplasma favorise la croissance des tumeurs cérébrales.Les exosomes de la microglie BV2 infectée par Toxoplasma ont été caractérisés et l'internalisation des cellules de gliome U87 a été confirmée.Les profils d'expression de microARN exosomal ont été analysés à l'aide de réseaux de microARN et de microARN-21A-5p associés à Toxoplasma gondii et au tri tumoral.Nous avons également étudié les niveaux d'ARNm des gènes associés aux tumeurs dans les cellules de gliome U87 en modifiant les niveaux de miR-21 dans les exosomes et l'effet des exosomes sur la prolifération des cellules de gliome humain U87.Dans les exosomes de cellules de gliome U87 infectées par Toxoplasma gondii, l'expression du microARN-21 est augmentée et l'activité des gènes antitumoraux (FoxO1, PTEN et PDCD4) est réduite.Les exosomes dérivés de BV2 infectés par Toxoplasma induisent la prolifération de cellules de gliome U87.Les exosomes induisent la croissance des cellules U87 dans un modèle de tumeur de souris.Nous suggérons qu'une augmentation de miR-21 exosomal dans la microglie BV2 infectée par Toxoplasma pourrait jouer un rôle important en tant que promoteur de croissance cellulaire dans les cellules de gliome U87 en régulant à la baisse les gènes antitumoraux.
On estime que plus de 18,1 millions de cas de cancer avancé ont été diagnostiqués dans le monde en 2018, avec environ 297 000 tumeurs du système nerveux central diagnostiquées chaque année (1,6 % de toutes les tumeurs)1.Des recherches antérieures ont montré que les facteurs de risque de développement de tumeurs cérébrales humaines comprennent divers produits chimiques, les antécédents familiaux et les rayonnements ionisants provenant des équipements thérapeutiques et diagnostiques de la tête.Cependant, la cause exacte de ces tumeurs malignes est inconnue.Environ 20 % de tous les cancers dans le monde sont causés par des agents infectieux, notamment des virus, des bactéries et des parasites3,4.Les agents pathogènes infectieux perturbent les mécanismes génétiques de la cellule hôte, tels que la réparation de l'ADN et le cycle cellulaire, et peuvent entraîner une inflammation chronique et des dommages au système immunitaire5.
Les agents infectieux associés au cancer humain sont les agents pathogènes viraux les plus courants, notamment les papillomavirus humains et les virus des hépatites B et C.Les parasites peuvent également jouer un rôle potentiel dans le développement du cancer humain.Plusieurs espèces de parasites, à savoir Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis et Hymenolepis nana, ont été impliquées dans divers types de cancers humains 6,7,8.
Toxoplasma gondii est un protozoaire intracellulaire qui régule le microenvironnement des cellules hôtes infectées.On estime que ce parasite infecte environ 30 % de la population mondiale, mettant l'ensemble de la population en danger9,10.Toxoplasma gondii peut infecter les organes vitaux, y compris le système nerveux central (SNC), et provoquer des maladies graves telles que la méningite et l'encéphalite mortelles, en particulier chez les patients immunodéprimés9.Cependant, Toxoplasma gondii peut également modifier l'environnement de l'hôte infecté en modulant la croissance cellulaire et les réponses immunitaires chez les individus immunocompétents, conduisant au maintien d'une infection chronique asymptomatique9,11.Fait intéressant, étant donné la corrélation entre la prévalence de T. gondii et l'incidence des tumeurs cérébrales, certains rapports suggèrent que les changements environnementaux de l'hôte in vivo dus à une infection chronique à T. gondii ressemblent au microenvironnement tumoral.
Les exosomes sont connus comme des communicateurs intercellulaires qui fournissent un contenu biologique, y compris des protéines et des acides nucléiques, à partir de cellules voisines16,17.Les exosomes peuvent influencer les processus biologiques liés à la tumeur tels que l'anti-apoptose, l'angiogenèse et les métastases dans le microenvironnement tumoral.En particulier, les miARN (miARN), petits ARN non codants d'environ 22 nucléotides de longueur, sont d'importants régulateurs de gènes post-transcriptionnels qui contrôlent plus de 30 % des ARNm humains par le biais du complexe de silençage induit par les miARN (miRISC).Toxoplasma gondii peut perturber les processus biologiques en contrôlant l'expression des miARN chez les hôtes infectés.Les miARN de l'hôte contiennent des signaux importants pour réguler les processus biologiques de l'hôte afin de réaliser la stratégie de survie du parasite.Ainsi, l'étude des changements dans le profil des miARN de l'hôte lors de l'infection par T. gondii peut nous aider à mieux comprendre l'interaction entre l'hôte et T. gondii.En effet, Thirugnanam et al.15 ont suggéré que T. gondii favorise la carcinogenèse cérébrale en modifiant son expression sur des miARN hôtes spécifiques associés à la croissance tumorale et ont découvert que T. gondii peut provoquer des gliomes chez des animaux de laboratoire.
Cette étude porte sur l'altération de l'exosomal miR-21 dans la microglie hôte infectée par Toxoplasma BV2.Nous avons observé un rôle possible de miR-21 exosomal altéré dans la croissance des cellules de gliome U87 en raison de la rétention dans le noyau de FoxO1/p27, qui est la cible de miR-21 surexprimé.
Les exosomes dérivés de BV2 ont été obtenus par centrifugation différentielle et validés par diverses méthodes pour éviter la contamination par des composants cellulaires ou d'autres vésicules.L'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) a montré des modèles distincts entre les protéines extraites des cellules BV2 et des exosomes (figure 1A), et des échantillons ont été évalués pour la présence d'Alix, qui a été analysée par Western blot de marqueurs de protéines exosomales dans .Le marquage Alix a été trouvé dans les protéines d'exosome mais pas dans les protéines de lysat de cellules BV2 (Fig. 1B).De plus, l'ARN purifié d'exosomes dérivés de BV2 a été analysé à l'aide d'un bioanalyseur.Les sous-unités ribosomiques 18S et 28S ont rarement été observées dans le schéma de migration de l'ARN exosomal, indiquant une pureté fiable (Figure 1C).Enfin, la microscopie électronique à transmission a montré que les exosomes observés avaient une taille d'environ 60 à 150 nm et avaient une structure en forme de coupe typique de la morphologie des exosomes (Fig. 1D).
Caractérisation d'exosomes dérivés de cellules BV2.(A) Fiche de données de sécurité.Les protéines ont été isolées à partir de cellules BV2 ou d'exosomes dérivés de BV2.Les modèles de protéines diffèrent entre les cellules et les exosomes.(B) Analyse Western blot d'un marqueur exosomal (Alix).(C) Évaluation de l'ARN purifié à partir de cellules BV2 et d'exosomes dérivés de BV2 à l'aide d'un bioanalyseur.Ainsi, les sous-unités ribosomiques 18S et 28S dans les cellules BV2 ont rarement été trouvées dans l'ARN exosomal.(D) La microscopie électronique à transmission a montré que les exosomes isolés des cellules BV2 étaient colorés négativement avec 2 % d'acétate d'uranyle.Les exosomes mesurent environ 60 à 150 nm et ont la forme d'une coupe (Song et Jung, données non publiées).
L'internalisation cellulaire des exosomes dérivés de BV2 dans les cellules de gliome humain U87 a été observée à l'aide de la microscopie confocale.Les exosomes marqués au PKH26 sont localisés dans le cytoplasme des cellules U87.Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (Fig. 2A), indiquant que les exosomes dérivés de BV2 peuvent être intériorisés par les cellules hôtes et influencer l'environnement des cellules réceptrices.
L'internalisation d'exosomes dérivés de BV2 dans des cellules de gliome U87 et d'exosomes dérivés de BV2 infectés par Toxoplasma RH a induit la prolifération de cellules de gliome U87.(A) Exosomes engloutis par les cellules U87 mesurés par microscopie confocale.Des cellules de gliome U87 ont été incubées avec des exosomes marqués au PKH26 (rouge) ou sans contrôle pendant 24 heures.Les noyaux ont été colorés au DAPI (bleu) puis observés au microscope confocal (barre d'échelle : 10 μm, x 3000).(B) La prolifération des cellules de gliome U87 a été déterminée par un test de prolifération cellulaire.Les cellules de gliome U87 ont été traitées avec des exosomes pendant le temps indiqué. *P < 0,05 a été obtenu par le test t de Student. *P < 0,05 a été obtenu par le test t de Student. *P < 0,05 pour t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 selon le test t de Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtenu à l'aide du test t de Student.
Après avoir confirmé l'internalisation des exosomes dérivés de BV2 dans les cellules de gliome U87, nous avons effectué des tests de prolifération cellulaire pour étudier le rôle des exosomes dérivés de BV2 dérivés de Toxoplasma dans le développement des cellules de gliome humain.Le traitement des cellules U87 avec des exosomes de cellules BV2 infectées par T. gondii a montré que les exosomes dérivés de BV2 infectés par T. gondii provoquaient une prolifération significativement plus élevée des cellules U87 par rapport au témoin (Fig. 2B).
De plus, la croissance des cellules U118 a eu les mêmes résultats que U87, car les exosomes stimulés par Toxoplasma ont provoqué les niveaux de prolifération les plus élevés (données non présentées).Sur la base de ces données, nous pouvons indiquer que les exosomes infectés par Toxoplasma dérivés de BV2 jouent un rôle important dans la prolifération des cellules de gliome.
Pour étudier l'effet des exosomes dérivés de BV2 infectés par Toxoplasma sur le développement tumoral, nous avons injecté des cellules de gliome U87 dans des souris nues pour un modèle de xénogreffe et injecté des exosomes dérivés de BV2 ou des exosomes dérivés de BV2 infectés par RH.Après que les tumeurs soient devenues apparentes après 1 semaine, chaque groupe expérimental de 5 souris a été divisé selon la taille de la tumeur pour déterminer le même point de départ, et la taille de la tumeur a été mesurée pendant 22 jours.
Chez les souris avec le modèle de xénogreffe U87, une taille et un poids de tumeur significativement plus importants ont été observés dans le groupe d'exosomes infectés par RH dérivé de BV2 au jour 22 (Fig. 3A, B).D'autre part, il n'y avait pas de différence significative dans la taille de la tumeur entre le groupe exosome dérivé de BV2 et le groupe témoin après traitement par exosome.De plus, les souris injectées avec des cellules de gliome et des exosomes affichaient visuellement le plus grand volume tumoral du groupe d'exosomes dérivés de BV2 infectés par RH (Fig. 3C).Ces résultats démontrent que les exosomes infectés par Toxoplasma dérivés de BV2 induisent la croissance de gliomes dans un modèle de tumeur de souris.
Oncogenèse (AC) des exosomes dérivés de BV2 dans un modèle murin de xénogreffe U87.La taille de la tumeur (A) et le poids (B) ont augmenté de manière significative chez les souris nues BALB/c traitées avec des exosomes infectés par RH dérivés de BV2.Des souris nues BALB/c (C) ont reçu une injection sous-cutanée de 1 x 107 cellules U87 en suspension dans un mélange de Matrigel.Six jours après l'injection, 100 μg d'exosomes dérivés de BV2 ont été traités chez la souris.La taille et le poids de la tumeur ont été mesurés aux jours indiqués et après le sacrifice, respectivement. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05。 *P < 0,05。 *Р < 0,05. *P < 0,05.
Les données ont montré que 37 miARN (16 surexprimés et 21 sous-exprimés) associés à l'immunité ou au développement tumoral étaient significativement altérés dans la microglie après infection par la souche Toxoplasma RH (Fig. 4A).Les niveaux d'expression relatifs de miR-21 parmi les miARN altérés ont été confirmés par RT-PCR en temps réel dans des exosomes dérivés de BV2, des exosomes traités avec des cellules BV2 et U87.L'expression de miR-21 a montré une augmentation significative des exosomes de cellules BV2 infectées par Toxoplasma gondii (souche RH) (Fig. 4B).Les niveaux d'expression relatifs de miR-21 dans les cellules BV2 et U87 ont augmenté après l'absorption d'exosomes modifiés (Fig. 4B).Les niveaux relatifs d'expression de miR-21 dans les tissus cérébraux des patients atteints de tumeur et des souris infectées par Toxoplasma gondii (souche ME49) étaient plus élevés que chez les témoins, respectivement (Fig. 4C).Ces résultats sont en corrélation avec les différences entre les niveaux d'expression des microARN prédits et confirmés in vitro et in vivo.
Modifications de l'expression de miP-21a-5p exosomal dans la microglie infectée par Toxoplasma gondii (RH).(A) Démontre des changements significatifs dans les siRNA associés à l'immunité ou au développement tumoral suite à une infection par T. gondii RH.(B) Les niveaux d'expression relatifs de miR-21 ont été détectés par RT-PCR en temps réel dans des exosomes dérivés de BV2, des exosomes traités par BV2 et des cellules U87.(C) Des niveaux d'expression relatifs de miR-21 ont été trouvés dans les tissus cérébraux de patients atteints de tumeur (N = 3) et de souris infectées par Toxoplasma gondii (souche ME49) (N = 3). *P < 0,05 a été obtenu par le test t de Student. *P < 0,05 a été obtenu par le test t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 a été obtenu à l'aide du test t de Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtenu à l'aide du test t de Student.
Les exosomes de cellules BV2 infectées par RH ont conduit à la croissance de gliomes in vivo et in vitro (Fig. 2, 3).Pour détecter les ARNm pertinents, nous avons examiné les niveaux d'ARNm des gènes cibles antitumoraux, la boîte à fourche O1 (FoxO1), le PTEN et la mort cellulaire programmée 4 (PDCD4) dans des cellules U87 infectées par des exosomes dérivés de BV2 ou RH BV2.L'analyse bioinformatique a montré que plusieurs gènes associés aux tumeurs, y compris les gènes FoxO1, PTEN et PDCD4, ont des sites de liaison miR-2121,22.Les niveaux d'ARNm des gènes cibles antitumoraux ont été réduits dans les exosomes dérivés de BV2 infectés par RH par rapport aux exosomes dérivés de BV2 (Fig. 5A).FoxO1 a montré des niveaux de protéines réduits dans les exosomes dérivés de BV2 infectés par RH par rapport aux exosomes dérivés de BV2 (figure 5B).Sur la base de ces résultats, nous avons pu confirmer que les exosomes dérivés de BV2 infectés par RH régulent à la baisse les gènes anti-oncogènes, maintenant leur rôle dans la croissance tumorale.
Les exosomes dérivés de BV2 infectés par Toxoplasma RH induisent la suppression des gènes antitumoraux dans les cellules de gliome U87 par les exosomes dérivés de BV2 infectés par Toxoplasma RH.(A) PCR en temps réel de l'expression de FoxO1, PTEN et PDCD4 dans des exosomes dérivés de BV2 infecté par T. gondii RH par rapport aux exosomes PBS.L'ARNm de la β-actine a été utilisé comme témoin.(B) L'expression de FoxO1 a été déterminée par Western blot et les données de densitométrie ont été statistiquement évaluées à l'aide du programme ImageJ. *P < 0,05 a été obtenu par le test t de Student. *P < 0,05 a été obtenu par le test t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 a été obtenu à l'aide du test t de Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtenu à l'aide du test t de Student.
Pour comprendre l'effet de miP-21 dans les exosomes sur la régulation des gènes associés à la tumeur, des cellules U87 ont été transfectées avec un inhibiteur de miP-21 à l'aide de Lipofectamine 2000 et les cellules ont été récoltées 24 heures après la transfection.Les niveaux d'expression de FoxO1 et p27 dans les cellules transfectées avec des inhibiteurs de miR-21 ont été comparés aux cellules traitées avec des exosomes dérivés de BV2 à l'aide de qRT-PCR (Fig. 6A, B).La transfection de l'inhibiteur de miR-21 dans des cellules U87 a considérablement régulé à la baisse l'expression de FoxO1 et de p27 (figure 6).
Le miP-21 dérivé de BV2 exosomal infecté par le RH a altéré l'expression de FoxO1/p27 dans les cellules de gliome U87.Les cellules U87 ont été transfectées avec un inhibiteur de miP-21 en utilisant Lipofectamine 2000 et les cellules ont été récoltées 24 heures après la transfection.Les niveaux d'expression de FoxO1 et p27 dans les cellules transfectées avec des inhibiteurs de miR-21 ont été comparés aux niveaux dans les cellules traitées avec des exosomes dérivés de BV2 à l'aide de qRT-PCR (A, B).
Pour échapper à la réponse immunitaire de l'hôte, le parasite Toxoplasma se transforme en kyste tissulaire.Ils parasitent divers tissus, y compris le cerveau, le cœur et les muscles squelettiques, tout au long de la vie de l'hôte et modulent la réponse immunitaire de l'hôte.De plus, ils peuvent réguler le cycle cellulaire et l'apoptose des cellules hôtes, favorisant leur prolifération14,24.Toxoplasma gondii infecte principalement les cellules dendritiques de l'hôte, les neutrophiles et la lignée des monocytes/macrophages, y compris la microglie cérébrale.Toxoplasma gondii induit la différenciation des macrophages de phénotype M2, affecte la cicatrisation des plaies après infection pathogène et est également associé à une hypervascularisation et à une fibrose granulomateuse.Cette pathogenèse comportementale de l'infection à Toxoplasma peut être liée à des marqueurs associés au développement tumoral.L'environnement hostile régulé par Toxoplasma peut ressembler au précancer correspondant.Par conséquent, on peut supposer que l'infection à Toxoplasma devrait contribuer au développement de tumeurs cérébrales.En fait, des taux élevés d'infection à Toxoplasma ont été rapportés dans le sérum de patients atteints de diverses tumeurs cérébrales.De plus, Toxoplasma gondii peut être un autre effecteur cancérigène et agir en synergie pour aider d'autres carcinogènes infectieux à développer des tumeurs cérébrales.À cet égard, il convient de noter que P. falciparum et le virus d'Epstein-Barr contribuent de manière synergique à la formation du lymphome de Burkitt.
Le rôle des exosomes en tant que régulateurs dans le domaine de la recherche sur le cancer a été largement étudié.Cependant, le rôle des exosomes entre les parasites et les hôtes infectés reste mal compris.Jusqu'à présent, divers régulateurs, y compris des protéines sécrétées, ont expliqué les processus biologiques par lesquels les parasites protozoaires résistent aux attaques de l'hôte et perpétuent l'infection.Récemment, il y a eu un concept croissant selon lequel les microvésicules associées aux protozoaires et leurs microARN interagissent avec les cellules hôtes pour créer un environnement favorable à leur survie.Par conséquent, d'autres études sont nécessaires pour découvrir la relation entre les miARN exosomal modifiés et la prolifération des cellules de gliome.L'altération des microARN (gènes du cluster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 et miR-17-92) se lie au promoteur STAT3 dans les macrophages humains infectés par le toxoplasme, est régulée et induit des -apoptose en réponse à une infection à Toxoplasma gondii 29 .L'infection à toxoplasme augmente l'expression de miR-17-5p et miR-106b-5p, qui sont associés à plusieurs maladies hyperprolifératives 30 .Ces données suggèrent que les miARN de l'hôte régulés par l'infection à Toxoplasma sont des molécules importantes pour la survie du parasite et la pathogenèse du comportement biologique de l'hôte.
Les miARN altérés peuvent influencer divers types de comportement lors de l'initiation et de la progression des cellules malignes, y compris les gliomes : autosuffisance des signaux de croissance, insensibilité aux signaux inhibiteurs de croissance, évasion de l'apoptose, potentiel réplicatif illimité, angiogenèse, invasion et métastase, et inflammation.Dans le gliome, des miARN altérés ont été identifiés dans plusieurs études de profilage d'expression.
Dans la présente étude, nous avons confirmé des niveaux élevés d'expression de miARN-21 dans les cellules hôtes infectées par le toxoplasme.miR-21 a été identifié comme l'un des microARN les plus fréquemment surexprimés dans les tumeurs solides, y compris les gliomes, 33 et son expression est en corrélation avec le grade du gliome.De nombreuses preuves suggèrent que miR-21 est un nouvel oncogène qui agit comme un facteur anti-apoptotique dans la croissance des gliomes et qui est fortement surexprimé dans les tissus et le plasma des tumeurs malignes du cerveau humain.Fait intéressant, l'inactivation de miR-21 dans les cellules et les tissus du gliome déclenche l'inhibition de la prolifération cellulaire due à l'apoptose dépendante de la caspase.L'analyse bioinformatique des cibles prédites par miR-21 a révélé plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs associés aux voies de l'apoptose, notamment la mort cellulaire programmée 4 (PDCD4), la tropomyosine (TPM1), le PTEN et la boîte à fourche O1 (FoxO1), avec le site de liaison miR-2121..22.38.
FoxO1, en tant que l'un des facteurs de transcription (FoxO), est impliqué dans le développement de divers types de cancers humains et peut réguler l'expression de gènes suppresseurs de tumeurs tels que p21, p27, Bim et FasL40.FoxO1 peut lier et activer des inhibiteurs du cycle cellulaire tels que p27 pour supprimer la croissance cellulaire.De plus, FoxO1 est un effecteur clé de la signalisation PI3K/Akt et régule de nombreux processus biologiques tels que la progression du cycle cellulaire et la différenciation cellulaire par l'activation de la transcription de p2742.
En conclusion, nous pensons que le miR-21 exosomal dérivé de la microglie infectée par Toxoplasma peut jouer un rôle important en tant que régulateur de croissance des cellules de gliome (Fig. 7).Cependant, d'autres études sont nécessaires pour trouver un lien direct entre le miR-21 exosomal, l'infection à Toxoplasma altérée et la croissance du gliome.Ces résultats devraient fournir un point de départ pour étudier la relation entre l'infection à Toxoplasma et l'incidence du gliome.
Un diagramme schématique du mécanisme de la carcinogenèse du gliome (cerveau) est proposé dans cette étude.L'auteur dessine dans PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Tous les protocoles expérimentaux de cette étude, y compris l'utilisation d'animaux, étaient conformes aux directives éthiques standard du Comité des soins aux animaux et des utilisateurs de l'Université nationale de Séoul et ont été approuvés par le Comité d'examen institutionnel de l'École de médecine de l'Université nationale de Séoul (numéro IRB SNU- 150715).-2).Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux recommandations ARRIVE.
La microglie de souris BV2 et les cellules de gliome humain U87 ont été cultivées dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM ; Welgene, Séoul, Corée) et le milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI ; Welgene), respectivement, chacun contenant 10 % de sérum bovin fœtal, 4 mM l- glutamine, pénicilline 0,2 mM et streptomycine 0,05 mM.Les cellules ont été cultivées dans un incubateur avec 5% de CO2 à 37°C.Une autre lignée cellulaire de gliome, U118, a été utilisée pour la comparaison avec les cellules U87.
Pour isoler les exosomes des souches RH et ME49 infectées par T. gondii, des tachyzoïtes de T. gondii (souche RH) ont été récoltés dans la cavité abdominale de souris BALB/c âgées de 6 semaines injectées 3 à 4 jours auparavant.Les tachyzoïtes ont été lavés trois fois avec du PBS et purifiés par centrifugation dans du Percoll à 40 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Pour obtenir des tachyzoïtes de la souche ME49, des souris BALB/c ont reçu une injection intrapéritonéale de 20 kystes tissulaires et la transformation des tachyzoïtes en kystes a été collectée en lavant la cavité abdominale le 6-8ème jour après l'infection (PI).Souris infectées par du PBS.Les tachyzoïtes ME49 ont été cultivés dans des cellules additionnées de 100 μg/ml de pénicilline (Gibco/BRL, Grand Island, NY, États-Unis), de 100 μg/ml de streptomycine (Gibco/BRL) et de 5 % de sérum bovin fœtal (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone.Après culture dans des cellules Vero, les tachyzoïtes ME49 ont été passés deux fois à travers une aiguille de calibre 25, puis à travers un filtre de 5 µm pour éliminer les débris et les cellules.Après lavage, les tachyzoïtes ont été remis en suspension dans du PBS44.Des kystes tissulaires de la souche ME49 de Toxoplasma gondii ont été maintenus par injection intrapéritonéale de kystes isolés du cerveau de souris C57BL/6 infectées (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Corée).Les cerveaux de souris infectées par ME49 ont été récoltés après 3 mois d'IP et hachés au microscope pour isoler les kystes.Les souris infectées ont été maintenues dans des conditions spéciales exemptes d'agents pathogènes (SPF) à l'École de médecine de l'Université nationale de Séoul.
L'ARN total a été extrait d'exosomes dérivés de BV2, de cellules et de tissus BV2 à l'aide du kit miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant, y compris le temps d'incubation pour l'étape d'élution.La concentration en ARN a été déterminée sur un spectrophotomètre NanoDrop 2000.La qualité des puces à ARN a été évaluée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Pays-Bas).
Le DMEM avec 10% de FBS pauvre en exosomes a été préparé par ultracentrifugation à 100 000 g pendant 16 heures à 4 ° C et filtré à travers un filtre de 0, 22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Les cellules BV2, 5 × 105, ont été cultivées dans du DMEM contenant 10 % de FBS appauvri en exosomes et 1 % d'antibiotiques à 37 °C et 5 % de CO2.Après 24 heures d'incubation, des tachyzoïtes de la souche RH ou ME49 (MOI = 10) ont été ajoutés aux cellules et les parasites non envahissants ont été éliminés en une heure et remplis de DMEM.Les exosomes des cellules BV2 ont été isolés par centrifugation différentielle modifiée, la méthode la plus largement utilisée.Remettre en suspension le culot d'exosome dans 300 pi de PBS pour l'analyse de l'ARN ou des protéines.La concentration des exosomes isolés a été déterminée à l'aide d'un kit d'analyse de protéines BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) et d'un spectrophotomètre NanoDrop 2000.
Les précipités de cellules BV2 ou d'exosomes dérivés de BV2 ont été lysés dans une solution d'extraction de protéines PRO-PREP ™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Corée) et les protéines ont été chargées sur des gels de polyacrylamide SDS à 10% colorés au bleu brillant de Coomassie.De plus, les protéines ont été transférées sur des membranes de PVDF pendant 2 heures.Les Western blots ont été validés en utilisant l'anticorps Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) comme marqueur exosomal.Des IgG anti-souris de chèvre conjuguées à la HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) et un analyseur d'images luminescent LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japon) ont été utilisés comme anticorps secondaire..La microscopie électronique à transmission a été réalisée pour étudier la taille et la morphologie des exosomes.Des exosomes isolés à partir de cellules BV2 (6,40 µg/µl) ont été préparés sur des mailles recouvertes de carbone et colorés négativement avec de l'acétate d'uranyle à 2 % pendant 1 min.Les échantillons préparés ont été observés à une tension d'accélération de 80 kV à l'aide d'un JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japon) équipé d'une caméra CCD ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Les exosomes dérivés de BV2 ont été colorés à l'aide du kit PKH26 Red Fluorescent Linker (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pendant 15 minutes à température ambiante.Des cellules U87, 2 × 105, avec des exosomes marqués au PKH26 (rouge) ou sans exosomes comme contrôle négatif, ont été incubées à 37 ° C pendant 24 heures dans un incubateur à 5% de CO2.Les noyaux des cellules U87 ont été colorés avec du DAPI (bleu), les cellules U87 ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min à 4 ° C, puis analysées dans un système de microscope confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Allemagne).observable.
L'ADNc a été synthétisé à partir d'ARNsi à l'aide de la synthèse du premier brin d'ARNsi Mir-X et du kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japon).Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide du système de détection de PCR en temps réel iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) en utilisant des amorces et des matrices mélangées avec du prémélange SYBR.L'ADN a été amplifié pendant 40 cycles de dénaturation à 95°C pendant 15 s et d'hybridation à 60°C pendant 60 s.Les données de chaque réaction PCR ont été analysées à l'aide du module d'analyse de données du logiciel du système optique iQ™5 (Bio-Rad).Les changements relatifs dans l'expression génique entre les gènes cibles sélectionnés et la β-actine/siARN (et U6) ont été calculés en utilisant la méthode de la courbe standard.Les séquences d'amorces utilisées sont présentées dans le tableau 1.
3 x 104 cellules de gliome U87 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et mélangées avec des exosomes infectés par Toxoplasma dérivés de BV2 (50 μg/mL) ou des exosomes non pulsés dérivés de BV2 (50 μg/mL) comme témoins à 12, 18 et 36 heures .Le taux de prolifération cellulaire a été déterminé à l'aide du Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japon) (Figures supplémentaires S1-S3) 46 .
Des souris nude BALB/c femelles âgées de 5 semaines ont été achetées chez Orient Bio (Seongnam-si, Corée du Sud) et maintenues individuellement dans des cages stériles à température ambiante (22 ± 2 °C) et humidité (45 ± 15 °C).%) à température ambiante (22±2°C) et humidité (45±15%).Un cycle de lumière de 12 heures et un cycle d'obscurité de 12 heures ont été réalisés sous SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Les souris ont été divisées au hasard en trois groupes de 5 souris chacun et tous les groupes ont reçu une injection sous-cutanée de 400 ml de PBS contenant 1 x 107 cellules de gliome U87 et un facteur de croissance réduit BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Six jours après l'injection tumorale, 200 mg d'exosomes dérivés de cellules BV2 (avec/sans infection à Toxoplasma) ont été injectés dans le site tumoral.Vingt-deux jours après l'infection de la tumeur, la taille de la tumeur des souris de chaque groupe a été mesurée avec un pied à coulisse trois fois par semaine, et le volume de la tumeur a été calculé par la formule : 0,5 × (largeur) × 2 × longueur.
Analyse de l'expression des microARN à l'aide de la matrice de miARN miRCURYTM LNA, matrices a, mmu et rno de 7e génération (EXIQON, Vedbaek, Danemark) couvrant 1119 souris bien caractérisées parmi 3100 sondes de capture de miARN humaines, de souris et de rat.Au cours de cette procédure, 250 à 1000 ng d'ARN total ont été éliminés du 5'-phosphate par traitement avec de la phosphatase alcaline intestinale de veau suivi d'un marquage avec un colorant fluorescent vert Hy3.Les échantillons marqués ont ensuite été hybridés en chargeant des lames de microréseau à l'aide d'un kit de chambre d'hybridation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) et d'un kit de lames d'hybridation (Agilent Technologies).L'hybridation a été réalisée pendant 16 heures à 56°C, puis les puces à ADN ont été lavées conformément aux recommandations du fabricant.Les lames de microréseau traitées ont ensuite été numérisées à l'aide d'un système de scanner de microréseau Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Les images numérisées ont été importées à l'aide du logiciel Agilent Feature Extraction version 10.7.3.1 (Agilent Technologies) et l'intensité de fluorescence de chaque image a été quantifiée à l'aide du fichier GAL correspondant du protocole Exiqon modifié.Les données des puces à ADN pour l'étude actuelle sont déposées dans la base de données GEO sous le numéro d'accession GPL32397.
Les profils d'expression des miARN exosomaux matures dans la microglie des souches RH ou ME49 infectées par Toxoplasma ont été analysés à l'aide de divers outils de réseau.Les miARN associés au développement de tumeurs ont été identifiés à l'aide de miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) et filtrés avec une intensité de signal normalisée (log2) supérieure à 8,0.Parmi les miARN, les miARN exprimés de manière différentielle se sont révélés être plus de 1,5 fois altérés par l'analyse par filtre des miARN altérés par les souches RH ou ME49 infectées par T. gondii.
Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à six puits (3 x 105 cellules/puits) dans opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Les cellules transfectées ont été cultivées pendant 6 heures puis le milieu a été remplacé par du milieu complet frais.Les cellules ont été récoltées 24 heures après la transfection.
L'analyse statistique a été principalement réalisée à l'aide du test t de Student avec le logiciel Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Pour l'analyse animale expérimentale, une ANOVA à deux voies a été réalisée à l'aide du logiciel Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les valeurs P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Les valeurs P <0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Les valeurs P <0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
Tous les protocoles expérimentaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par le Comité d'examen institutionnel de l'École de médecine de l'Université nationale de Séoul (numéro IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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