Giardia duodenum est un organisme parasitaire responsable de la giardiase, une infection intestinale particulièrement fréquente chez les jeunes enfants présentant des signes cliniques de diarrhée.Nous avons précédemment signalé que le G. duodenalis extracellulaire déclenche l'activation des nucléotides de liaison au récepteur 3 de type oligomérisation intracellulaire (NLRP3) et régule les réponses inflammatoires de l'hôte par la sécrétion de vésicules extracellulaires (EV).Cependant, les modèles moléculaires exacts du duodénocoque EV (GEV) associé à l'agent pathogène impliqué dans ce processus et le rôle de l'inflammasome NLRP3 dans la giardiase restent à élucider.
Les plasmides d'expression eucaryotes recombinants pcDNA3.1(+)-alpha-2 et alpha-7.3 giardines dans GEV ont été construits, transfectés dans des macrophages péritonéaux primaires de souris et détectés en mesurant la molécule cible de l'inflammation, la caspase-1.Le niveau d'expression de p20 a été examiné..Les giardines G. duodenalis alpha-2 et alpha-7.3 ont été identifiées à l'origine en mesurant l'inflammasome NLRP3 (NLRP3, pro-interleukine-1 bêta [IL-1β], pro-caspase-1 et caspase-1 p20), la sécrétion d'IL.Niveaux 1β, niveaux d'oligomérisation de la protéine tachetée apoptotique (ASC) et localisation immunofluorescente de NLRP3 et ASC.Le rôle de l'inflammasome NLRP3 dans la pathogénicité de G. duodenalis a ensuite été évalué chez des souris chez lesquelles l'activation de NLRP3 était bloquée (souris bloquées par NLRP3) et les modifications pathologiques du poids corporel, de la charge parasitaire duodénale et du tissu duodénal ont été surveillées.De plus, nous avons étudié si les hiardines alpha-2 et alpha-7.3 induisaient la sécrétion d'IL-1β in vivo via l'inflammasome NLRP3 et déterminé le rôle de ces molécules dans la pathogénicité de G. duodenalis chez la souris.
Les giardines alpha-2 et alpha-7.3 induisent l'activation de l'inflammasome NLRP3 in vitro.Cela a conduit à l'activation de la p20 caspase-1, à une augmentation des niveaux d'expression des protéines NLRP3, pro-IL-1β et pro-caspase-1, à une augmentation significative de la sécrétion d'IL-1β, à la formation de taches d'ASA dans le cytoplasme et l'induction de l'oligomérisation de l'ASA.Inflammation de NLRP3 La perte du pénis exacerbe le pouvoir pathogène de G. duodenalis chez la souris.Les souris traitées avec des kystes par gavage provenant de souris bloquées par NLRP3 présentaient un nombre accru de trophozoïtes et de graves dommages aux villosités duodénales, caractérisés par des cryptes nécrotiques rétrécies et ramifiées.Des expériences in vivo ont montré que les giardines alpha-2 et alpha-7.3 peuvent induire la sécrétion d'IL-1β via l'inflammasome NLRP3, et que l'immunisation avec les giardines alpha-2 et alpha-7.3 a réduit le pouvoir pathogène de G. duodenalis chez la souris.
Pris ensemble, les résultats de cette étude suggèrent que les giardia alpha-2 et alpha-7.3 provoquent une régulation positive de l'inflammation de l'hôte NLRP3 et réduisent le pouvoir infectieux de G. duodenalis chez la souris, qui sont des cibles prometteuses pour prévenir la giardiase.
Giardia duodenum est un parasite protozoaire extracellulaire qui vit dans l'intestin grêle et provoque chaque année 280 millions de cas de giardiase avec diarrhée, en particulier chez les jeunes enfants des pays en développement [1].Les personnes sont infectées en buvant de l'eau ou des aliments contaminés par des kystes de M. duodenum, qui pénètrent ensuite dans l'estomac et sont excrétés dans les sucs gastriques.Les trophozoïtes de Giardia duodenum s'attachent à l'épithélium duodénal, provoquant des nausées, des vomissements, de la diarrhée, des douleurs abdominales et une perte de poids.Les personnes souffrant d'immunodéficience et de fibrose kystique sont sensibles à l'infection.L'infection peut également survenir lors de relations sexuelles orales et anales [2].Les médicaments tels que le métronidazole, le tinidazole et le nitazoxanide sont les options thérapeutiques privilégiées pour les infections duodénales [3].Cependant, ces médicaments de chimiothérapie provoquent des effets secondaires indésirables tels que des nausées, une carcinogenèse et une génotoxicité [4].Par conséquent, des stratégies plus efficaces doivent être développées pour prévenir l’infection par G. duodenalis.
Les inflammasomes sont une classe de complexes protéiques cytosoliques qui font partie de la réponse immunitaire innée, aidant à se défendre contre l'invasion d'agents pathogènes et à médier les réponses inflammatoires [5].Parmi ces inflammasomes, l'inflammasome de type oligomérisation de liaison aux nucléotides (NOD) 3 (NLRP3) et oligomérisation de liaison aux nucléotides (NLRP3) a été étudié de manière approfondie car il peut être détecté par divers modèles moléculaires associés à des agents pathogènes/dommages (PAMP/ DAMP), reconnaît, active le système immunitaire inné.et régule l'homéostasie intestinale dans de nombreuses maladies inflammatoires [6,7,8].Il se compose du récepteur de reconnaissance de formes (PRR) NLRP3, d'une protéine tachetée apoptotique adaptatrice (ASC) et d'un effecteur procaspase-1 ou procaspase-11.L'inflammasome NLRP3 agit comme un hôte contre l'invasion d'agents pathogènes, comme observé dans les études sur Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] et Leishmania.[11], mais il a également été rapporté que l'activation de l'inflammasome NLRP3 limite les réponses immunitaires protectrices et exacerbe la progression de la maladie, par exemple chez les vers [12].Sur la base de nos découvertes précédentes, nous avons signalé que G. duodenalis extracellulaire déclenche l'activation intracellulaire de l'inflammation de NLRP3 et module les réponses inflammatoires de l'hôte en sécrétant des vésicules extracellulaires (VE) (13).Cependant, le rôle de l'inflammasome NLRP3 dans l'infection à G. duodenalis in vivo reste à déterminer.
Les giardins ont été initialement décrits comme des composants structurels du cytosquelette de G. duodenalis et jouent un rôle important dans la motilité des trophozoïtes et la fixation des cellules épithéliales dans l'intestin grêle.Pour mieux s'adapter à l'environnement et augmenter leur pathogénicité, les trophozoïtes de G. duodenalis ont développé une structure cytosquelettique unique composée de 8 flagelles, 1 corps médian et 1 disque ventral [14].Les trophozoïtes de Giardia duodenum utilisent leur cytosquelette pour pénétrer dans la partie supérieure de l'intestin grêle, en particulier le duodénum, ​​et s'attacher aux entérocytes.Ils migrent constamment et s'attachent aux cellules épithéliales grâce au métabolisme cellulaire.Il existe donc une relation étroite entre leur cytosquelette et leur virulence.Les giardines spécifiques de Giardia duodenum sont des composants de la structure du cytosquelette [15] et sont divisées en quatre classes : α-, β-, γ- et δ-giardines.Il existe 21 membres de la famille des α-giardines, qui ont tous une capacité dépendante du calcium à se lier aux phospholipides [16].Ils relient également le cytosquelette à la membrane cellulaire.Chez les individus souffrant de diarrhée causée par G. duodenalis, les α-giardines sont fortement exprimées et immunoréactives lors de l'infection (17).Les vaccins hétérologues basés sur Giardia alfa-1 protègent contre la giardiase chez la souris et sont des antigènes candidats potentiels pour le développement de vaccins [18].L'alpha-8 giardin, localisée dans la membrane plasmique et les flagelles, mais pas dans le disque ventral, améliore la motilité et le taux de croissance des trophozoïtes chez G. duodenalis (19).L'alpha-14 giardin s'attache aux structures microtubulaires des flagelles et affecte la viabilité de G. duodenalis (20).L'alpha-11 giardine est présente en abondance tout au long du cycle de vie, et la surexpression de l'alpha-11 giardine endommage G. duodenalis lui-même (21).Cependant, il n'est pas clair si l'alpha-2 giardine et l'alpha-7.3 giardine protègent contre l'infection à G. duodenalis et leurs mécanismes sous-jacents.
Dans cette étude, les plasmides d'expression eucaryotes recombinants pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine et pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ont été transfectés dans des macrophages péritonéaux primaires de souris pour activer le NLRP3 hôte.Les cibles inflammatoires ont ensuite été examinées.Nous avons également évalué le rôle de l'inflammasome NLRP3 dans la pathogénicité de G. duodenalis, examiné si les giardines alpha-2 et alpha-7,3 induisaient l'activation de l'inflammasome NLRP3 in vivo et déterminé que ces deux rôles des giardines dans la pathogénicité de G. duodenalis.Notre objectif commun était de développer des cibles prometteuses pour la prévention de l'infection à G. duodenalis.
Des souris femelles C57BL/6 de type sauvage (WT) âgées de 5 à 8 semaines ont été achetées au Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Chine).Les souris avaient libre accès à l’eau, recevaient de la nourriture stérilisée et étaient maintenues dans un cycle lumière/obscurité de 12/12 heures.Avant l’infection, les souris recevaient des antibiotiques ad libitum dans de l’eau potable complétée par de l’ampicilline (1 mg/mL), de la vancomycine (1 mg/mL) et de la néomycine (1,4 mg/mL) (tous achetés à Shanghai, Chine, organismes artificiels) [ 22 ].].Les souris qui ont perdu la capacité de manger et de boire pendant > 24 heures et qui ont perdu ≥ 20 % de leur poids corporel ont été euthanasiées sans cruauté par luxation cervicale.
Les trophozoïtes WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, États-Unis) ont été complétés avec 12,5 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Every Green, Zhejiang, Chine) et 0,1 % de bile bovine (Sigma-Aldrich, St. Missouri, États-Unis). ).USA) dans des conditions microaérobies.Les trophozoïtes confluents ont été collectés sur de la glace et passés dans un rapport de 1:4 pour une reproduction ultérieure.
Les kystes de Giardia duodenum ont été induits comme décrit précédemment [23], les trophozoïtes ont été récoltés en phase logarithmique puis dilués avec un milieu induisant l'encapsulation, pH 7,1 (TYI-S-33 modifié) jusqu'à une concentration finale de 1 × 106 trophozoïtes/mL.concentration biliaire 0,05% moyenne).Les trophozoïtes ont été cultivés dans des conditions anaérobies à 37°C jusqu'à la phase de croissance logarithmique.Changer le milieu en milieu induisant des kystes (pH 7,8 ; milieu TYI-S-33 modifié avec 1 % de concentration de bile) et cultiver G. duodenalis à 37 °C pendant 48 à 96 heures, au cours desquelles la formation de kystes a été observée au microscope.Après que la plupart des trophozoïtes aient été amenés à former des kystes, le mélange de culture a été récolté et remis en suspension dans de l'eau déminéralisée stérile pour lyser les trophozoïtes restants.Les kystes ont été comptés et conservés à 4°C pour des analyses ultérieures via une sonde gastrique chez la souris.
Les vésicules extracellulaires de Giardia (GEV) ont été enrichies comme décrit précédemment (13).Les trophozoïtes en phase de croissance logarithmique ont été remis en suspension dans un milieu TYI-S-33 modifié préparé avec du FBS appauvri en exosomes (Biological Industries, Beit-Haemek, Israël) jusqu'à une concentration finale de 1 × 106 parasites/mL et incubés pendant 12 heures.ont été isolés du surnageant de culture par centrifugation à 2 000 g pendant 10 min, 10 000 g pendant 45 min et 100 000 g pendant 60 min.Les précipités ont été dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), quantifiés à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et stockés à -80 ° C ou utilisés directement pour des analyses ultérieures.
Les macrophages péritonéaux primaires de souris ont été préparés comme décrit précédemment (24).En bref, des souris (âgées de 6 à 8 semaines) ont reçu une injection (par voie intrapéritonéale [ip]) de 2, 5 ml de milieu thioglycol liquide Difco à 2, 98% (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) et ont nourri 3 à 4 palais.Une suspension de macrophages a été prélevée dans la cavité abdominale de souris après euthanasie et centrifugée 3 fois à 1 000 g pendant 10 min.Les cellules récoltées ont été détectées par cytométrie en flux à l'aide du marqueur CD11b jusqu'à ce que la pureté cellulaire soit > 98 %, puis ajoutées à des plaques de culture cellulaire à 6 puits (4,5 x 106 cellules/puits) et incubées avec 10 % de FBS (Bioindustrie) à 37°C.et 5% de CO2.
L'ARN a été extrait de 1 × 107 trophozoïtes dans 1 ml de réactif TRIzol (Vazyme, Nanjing, Chine), l'ADN génomique a été extrait de l'ARN total de G. duodenalis en utilisant la dsDNase MonScript (Monad, Wuhan, Chine) et l'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé. en utilisant MonScript RTIIII Super Mix (Monad) selon les instructions du fabricant.
Les informations sur la séquence CDS pour le gène cible de G. duodenalis ont été obtenues auprès de la NCBI GenBank.Utilisez Primer 5.0 pour concevoir des amorces de clonage transparentes spécifiques pour chaque gène cible.L'amorce directe (5′-3′) se compose de trois parties : une séquence superposée avec un vecteur linéarisé pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) et des codons d'initiation ATG et GNN (si la première base n'est pas G).Ceci est fait pour améliorer l’efficacité de l’expression.De plus, au moins 16 pb de bases combinées (teneur en GC 40–60 %/Tm environ 55 °C).L'amorce inverse (5′-3′) se compose de deux parties, une séquence superposée avec un vecteur pcDNA3.1(+) linéarisé par EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) et une base combinée d'au moins 16 pb.(hors les deux derniers arrêts).bases) un codon tel que AA ou GA pour permettre aux plasmides recombinants d'exprimer leurs protéines marquées).Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau 1 et ont été synthétisées par Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Chine).
Les cibles ont été amplifiées à l'aide de l'ADN polymérase Pfu (Tiangen, Pékin, Chine) ou Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pékin, Chine) en utilisant l'ADNc de G. duodenalis préparé comme matrice.Le plasmide vecteur d'expression eucaryote pcDNA3.1(+) a été linéarisé avec l'enzyme de restriction EcoRV et déphosphorylé en utilisant Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Les fragments pcDNA3.1 (+) linéarisés et les fragments de gène cible amplifiés ont été purifiés à l'aide d'un kit de purification sur gel d'ADN (Tiangen) et quantifiés à l'aide d'un Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Le fragment pcDNA3.1(+) et chaque fragment de gène cible ont été recombinés à l'aide du mélange de clonage à assemblage unique MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Chine) et confirmés par séquençage de l'ADN à l'aide de Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Chine)..
Les plasmides sans endotoxine pcDNA3.1(+)-alpha-2 et pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ont été générés à l'aide du mini kit plasmide sans endotoxine SanPrep (Sangon Biotech).La concentration a été maintenue au-dessus de 500 ng/µl pour garantir que l'EDTA dans le tampon d'élution n'interfère pas avec le test de transfection.Les macrophages péritonéaux primaires de souris ont été cultivés dans des plaques à 6 puits avec du milieu RPMI 1640 complet (Biological Industries) pendant 12 heures, puis les cellules ont été lavées 3 fois dans du PBS chaud pour éliminer la pénicilline et la streptomycine, puis dans un milieu additionné de milieu complet.Les plasmides sans endotoxines pcDNA3.1(+)-alpha-2 et pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 µg) ont été dilués dans 125 µl de milieu sérique réduit Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Ensuite, 5 µl de réactif de transfection Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ont été dilués dans 125 µl de milieu Opti-MEM à faible teneur en sérum.Préparer les complexes liposome-ADN en mélangeant le plasmide dilué sans endotoxine avec de la Lipofectamine 2000 et en laissant le mélange reposer à température ambiante pendant 5 minutes.Transférer les complexes séparément dans les cellules de chaque puits et mélanger lentement.Au bout de 4 heures, le milieu de culture cellulaire a été remplacé par 2 ml de milieu RPMI 1640 complet et la culture a été poursuivie pendant 24 heures.Du milieu de culture cellulaire frais a été ajouté aux cellules et incubé pendant différents moments en fonction de la conception du test.
Des échantillons de protéines provenant des surnageants et des lysats cellulaires ont été préparés comme décrit précédemment (25).Les paramètres de transfert membranaire pour la pro-IL-1β, la pro-caspase-1, la caspase-1 p20, le NLRP3, la β-actine et le His-tag étaient de 200 mA/90 min.Pour l'interleukine 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), la caspase-1 (p20) (Adipogen, Suisse) et NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Suisse) et 1:5000 ciblant Son tag (Amylet Scientific, Wuhan, Chine) et β-actine (Proteintech, Wuhan, Chine).
La réticulation avec le suberate de disuccinimide (DSS) a été réalisée comme décrit précédemment (26).Les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS froid et complètement lysées avec une aiguille de calibre 27 dans 50 µl de tampon de réaction ASC (pH 8,0) contenant 25 mM de Na2PO4, 187,5 mM de NaCl, 25 mM de HEPES et 125 mM de NaHCO3.Le mélange a été centrifugé à 5 000 g pendant 3 min et le culot a été suturé avec 10 µl de DSS (25 mM dans du DMSO) et 40 µl de tampon de réaction ASC pendant 30 min à 37°C.Après centrifugation à 5 000 g pendant 10 min, le culot a été dissous dans une solution de 40 µl de tampon de réaction ASC et 10 µl de tampon de chargement de protéines 6x (TransGen, Pékin, Chine), puis la solution a été trempée à température ambiante pendant 15 minutes. min., Puis faites bouillir 10 minutes.Les échantillons de protéines ont ensuite été soumis à un Western blot utilisant des anticorps primaires anti-ASC (Wanleibio, Shenyang, Chine) à un rapport de dilution de 1: 500.
Suite à une procédure décrite précédemment [13], les surnageants de culture cellulaire ont été récoltés et la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β a été déterminée à l'aide du kit IL-1 Beta ELISA de souris (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Convertissez les valeurs OD450nm en concentrations de protéines à l'aide de la courbe standard IL-1β.
Les cellules recouvertes de lamelles ont été délicatement lavées 3 fois dans du PBS chaud, fixées dans un fixateur de cellules tissulaires (Biosharp, Pékin, Chine) pendant 10 min à température ambiante (RT), dans 0,1 % de Triton X-Permeabilize à 100 °C (dilué dans du PBS ; Biosharp ) pendant 20 minutes à température ambiante et bloquer dans 5% d'albumine sérique bovine (dans du PBS) pendant 2 heures à température ambiante.Les cellules ont ensuite été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires contre l'ASC (dilution 1: 100) ou NLRP3 (dilution 1: 100), respectivement, et des IgG (H + L) anti-lapin de chèvre marquées Cy3 (1: 400; EarthOx , San Francisco, Californie, États-Unis) ou des IgG anti-souris de chèvre conjuguées au FITC (1 : 400 ; Earthox) pendant la nuit à 37 °C dans l'obscurité pendant 1 heure.Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst 33258 (10 µg/ml ; UE, Suzhou, Chine) pendant 5 minutes et observés au microscope à fluorescence (Olympus Corporation, Tokyo, Japon).
Les souris ont été divisées en quatre groupes (n = 7 dans chaque groupe) : (i) groupe témoin négatif traité au PBS (PBS uniquement ; gavage 100 µl/PBS de souris suivi d'une injection intrapéritonéale quotidienne de 100 µl/PBS de souris 3 heures plus tard)., en continu pendant 7 jours) ;(ii) groupe témoin négatif traité avec l'inhibiteur du MCC950 [27] (100 µl/souris par gavage au PBS, 3 heures plus tard, 10 mg/kg de poids corporel [BW] MCC950 [dans le PBS] ont été administrés par voie intrapéritonéale quotidiennement, pendant 7 jours) ;(iii) Groupe d'infection par kyste de G. duodenalis (1,5 x 106 kystes/souris par gavage, 3 heures plus tard, 100 μl/souris de PBS administré par voie intrapéritonéale quotidiennement pendant 7 jours) ;(iv) Groupe d'infection combinée par kyste de G. duodenalis Groupe de traitement par inhibiteur du MCC950 (1,5 × 106 kystes/souris par gavage, 10 mg/kg de poids corporel de MCC950 par voie intrapéritonéale par jour pendant 7 jours à 3 h).Le poids corporel de chaque souris a été surveillé quotidiennement et toutes les souris ont été euthanasiées le 7ème jour.Le duodénum récolté (3 cm de long) a été coupé en petits morceaux dans 1 ml de PBS, les kystes ont été détruits pendant une nuit dans du PBS à 4 ° C et les trophozoïtes de G. duodenalis.Duodénum frais (1 cm de long) a été isolé pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E).
Les souris ont été divisées en deux groupes : (i) le groupe témoin MOCK et (ii) le groupe inhibiteur de MCC950.Il y a eu cinq traitements dans chaque groupe (n = 7/groupe de traitement) : (i) groupe témoin négatif de traitement PBS (PBS uniquement ; 100 µl/souris PBS, injection intramusculaire (IM) (tibial antérieur) [28, 29] ;( ii) groupe témoin négatif plasmidique pcDNA3.1(+) (100 µg/ADN de souris, par injection intramusculaire) ; (iii) groupe témoin positif d'infection par kyste de G. duodenalis (1,5 x 106 kystes/souris, par gavage) (iv) a groupe traité avec le plasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 µg/ADN de souris, par injection intramusculaire), et (v) un groupe traité avec le plasmide pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/souris ADN, après 12 heures de passage, les souris du groupe inhibiteur de MCC950 ont reçu une injection intrapéritonéale quotidienne de MCC950 (10 mg/kg de poids corporel) pendant 7 jours, tandis que les souris du groupe MOCK ont reçu un volume égal de traitement au PBS. Des échantillons de sang ont été prélevés sur les globes oculaires de souris et laissés toute la nuit à 4 ° C. Des échantillons de sérum ont été isolés à l'aide d'un test immuno-enzymatique (ELISA) et de mesures des niveaux d'IL-1β.
Trente-cinq souris ont été divisées en cinq groupes (n = 7/groupe).Le groupe 1 était un groupe témoin négatif traité au PBS : les souris ont reçu 100 µl de PBS par voie intramusculaire et 3 jours plus tard par gavage.Le groupe 2 est un groupe témoin positif infecté par des kystes de G. duodenalis : des souris ont reçu une injection de 100 µl de PBS, et 3 jours plus tard, 1,5 x 106 kystes/souris ont été injectés par voie intragastrique.Troisième groupe – immunisation plasmidique avec pcDNA3.1(+) en combinaison avec un groupe témoin pour l'infection par le kyste duodénal : les souris ont reçu 100 µg d'ADN plasmidique pcDNA3.1(+)(im) par voie orale, 1,5×106 kystes/souris 3 pendant plusieurs jours.Les groupes 4 et 5 étaient le plasmide recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ou le plasmide pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine en combinaison avec une infection par un kyste de G. duodenalis.Groupe expérimental : les souris ont reçu 100 µg de pcDNA3.ADN plasmidique 1(+)-giardine (im), puis 3 jours plus tard, 1,5 × 106 kystes/souris ont été injectés par gavage.Le poids corporel de chaque souris a été surveillé après l'introduction du kyste de G. duodenalis à travers le tube.Du duodénum frais a été collecté pour les mesures de la charge parasitaire et l'analyse de la coloration HE.
Les changements histopathologiques ont été analysés selon une procédure publiée précédemment [30].Le duodénum frais a été fixé avec un fixateur de cellules tissulaires, incorporé dans de la paraffine, coupé en sections de 4 µm, coloré au H&E et analysé au microscope optique.Des changements pathologiques représentatifs dans sept coupes de tissus provenant de sept souris indépendantes ont été évalués par un pathologiste ignorant le traitement et ont été capturés avec un grossissement de 200x.La longueur des villosités et la profondeur des cryptes ont été mesurées conformément aux méthodes décrites précédemment.
Les résultats in vitro et in vivo ont été obtenus en triple.Les graphiques ont été générés à l'aide de GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Les différences entre deux groupes ont été analysées par test t, tandis que les différences entre ≥ 3 groupes ont été analysées par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) à l'aide du logiciel SPSS (version 22.0 ; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Les données ont été analysées pour déterminer l'homogénéité de la variance à l'aide du test de Levene suivi du test post hoc de Bonferroni (B).La signification est exprimée par P <0,05, P <0,01 et P <0,001 (non significatif [ns]) (P>0,05).
Notre précédente analyse de la protéomique du GEV dans l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) a montré que de nombreuses cibles peuvent être impliquées dans l'activation des voies de signalisation inflammatoires (13).Nous avons sélectionné deux cibles prometteuses, les giardines alpha-2 et alpha-7.3, amplifié ces molécules et les avons utilisées pour construire le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3.1(+).Après séquençage, les plasmides d'expression recombinants pcDNA3.1(+)-alpha-2 et alpha-7.3 giardine ont été transfectés dans des macrophages péritonéaux primaires de souris, et la protéine signature de l'inflammation caspase-1 p20 (un fragment de caspase-1 activée) a été identifiée. comme élucidant les molécules clés qui peuvent déclencher une inflammation.Les résultats ont montré que les giardines alpha-2 et alpha-7.3 peuvent induire une expression de p20 caspase-1 similaire à celle du GEV.Aucun effet sur l'activation de la caspase-1 n'a été constaté dans le contrôle négatif non traité (PBS uniquement) et le contrôle plasmidique pcDNA3.1(+) (Figure 1).
Mesure de l'activation de la p20 caspase-1 par les giardines pcDNA3.1(+)-alpha-2 et alpha-7.3.Les plasmides d'expression eucaryotes recombinants pcDNA3.1(+)-alpha-2 et alpha-7.3 giardines (au-dessus de chaque piste) ont été transfectés dans des macrophages péritonéaux primaires de souris et les surnageants de culture ont été récoltés 24 heures plus tard.Le Western blot a été utilisé pour mesurer les niveaux d’expression de la protéine signature de l’inflammasome caspase-1 p20.Le groupe de traitement PBS uniquement (piste C) et le groupe de monothérapie pcDNA3.1 (+) (piste pcDNA3.1) ont été utilisés comme contrôle négatif, et le groupe de traitement GEV a été utilisé comme contrôle positif.L'expression de la protéine recombinante a été confirmée par la détection d'une étiquette histidine dans chaque protéine, et les bandes protéiques attendues étaient l'alpha-2 giardine (38,2 kDa) et l'alpha-7,3 giardine (37,2 kDa).GEV, vésicules extracellulaires de Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vecteur linéarisé EcoRV, SUP, surnageant
Pour déterminer si l'alpha-2 giardine et l'alpha-7.3 giardine induisent l'expression de la p20 caspase-1 et jouent un rôle dans l'activation de la réponse inflammatoire NLRP3 de l'hôte, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine et pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin a été transfecté dans des macrophages péritonéaux primaires de souris avec de l'ADN plasmidique recombinant, et les niveaux d'expression, de localisation et d'oligomérisation des protéines inflammatoires clés NLRP3 ont été déterminés.Dans cette expérience, GEV a été utilisé comme groupe témoin positif, et le groupe sans traitement (PBS uniquement) ou le groupe de traitement par transfection pcDNA3.1(+) était le groupe négatif.Les résultats ont montré que, comme dans le groupe GEV, l'ADN plasmidique recombinant de la giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2 et de la giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 entraînait une régulation positive de NLRP3, pro-IL-1β et activation de la procaspase-1 et de la caspase-1 (Fig. 2a).De plus, les deux giardines ont induit une sécrétion significative d'IL-1β (pcDNA3.1 : ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000 ; alpha-2 giardine : ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007. ).;alpha-7,3 giardine : ANOVA, F (4, 10) = 1,625, P <0,0001 ;GEV : ANOVA, F (4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figure 2b).La plupart des protéines ASC étaient monomères dans le groupe sans traitement ou dans le groupe de traitement transfecté avec le plasmide pcDNA3.1(+), contrairement à pcDNA3.1(+)-alpha-2 ou pcDNA3.1(+)-alpha-2. 7.3 jardin.L'oligomérisation de l'ASC s'est produite dans l'ADN plasmidique recombinant du groupe ou du groupe témoin positif GEV, montrant une forme oligomère (Figure 2c).Ces données préliminaires suggèrent que l'alpha-2 giardine et l'alpha-7,3 giardine peuvent induire l'activation de l'inflammation NLRP3.Des études immunofluorescentes ultérieures sur la localisation de l'ASC et du NLRP3 ont montré que dans le groupe témoin négatif, la protéine ASC était dispersée dans tout le cytoplasme et apparaissait sous la forme d'un signal ponctuel lors de la stimulation de pcDNA3.1(+)-alpha-2 avec de la giardine ou de pcDNA3.Groupe 1(+)-alpha-7,3 giardine ou groupe témoin positif GEV (Figure 2d).Dans les groupes pcDNA 3.1 témoins négatifs et traités au plasmide, le signal de la protéine NLRP3 n'a pas été détecté, tandis qu'un point de signal fluorescent en réponse à pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ou pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 a été détecté..les giardines se trouvent dans le cytoplasme ou lors de la stimulation du VHE (Fig. 2e).Ces données démontrent en outre que G. duodenalis giardin alpha-2 et giardin alpha-7.3 activent l'inflammasome NLRP3 dans les macrophages péritonéaux primaires de souris.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin et pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin activent l'inflammasome NLRP3 dans les macrophages péritonéaux de souris.Transfecter les plasmides d'expression eucaryotes recombinants pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin et pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin dans des macrophages et cellules péritonéaux murins primaires, ou récolter le surnageant dans les 24 h pour analyse de l'expression, oligomérisation , sécrétion.et la localisation des protéines inflammatoires clés.Le groupe PBS uniquement (C) et le groupe de traitement unique pcDNA3.1 (+) ont été utilisés comme contrôle négatif, et le groupe de traitement GEV a été utilisé comme groupe positif.a Les protéines inflammatoires clés NLRP3, notamment NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 et p20 caspase-1, ont été détectées par Western blot.b Les niveaux de sécrétion d'IL-1β dans les surnageants ont été déterminés à l'aide d'un test immuno-enzymatique (ELISA).Les différences entre les groupes témoins et expérimentaux ont été analysées par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) à l'aide du logiciel SPSS version 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives entre les groupes ** P <0,01 et *** P <0,001.c Les niveaux d'oligomérisation d'ASC dans les pellets ont été déterminés par analyse de réticulation DSS, tandis que les niveaux d'ASC dans les lysats cellulaires ont été utilisés comme contrôle de charge.d Visualisation de la localisation ISC par immunofluorescence.L'immunofluorescence a été utilisée pour visualiser la localisation de NLRP3.ASC, protéine apoptotique ressemblant à un point ;IL, interleukine;NLRP3, récepteur 3 de type oligomérisation se liant aux nucléotides ;ns, non significatif (P > 0,05)
G. duodenalis et les GEV qu'il sécrète activent l'inflammasome NLRP3 et régulent les réponses inflammatoires de l'hôte in vitro.Ainsi, le rôle de l'inflammasome NLRP3 dans la pathogénicité de G. duodenalis reste flou.Pour étudier ce problème, nous avons conçu une expérience entre des souris infectées par un kyste de G. duodenalis et des souris infectées par un kyste de G. duodenalis + un traitement par inhibiteur de MCC950 et avons comparé l'expression de l'inflammasome NLRP3 lorsqu'elles étaient infectées par un kyste de G. duodenalis.Un schéma détaillé de l'expérience est présenté sur la figure 3a.Les modifications du poids corporel des souris dans différents groupes de traitement ont été surveillées pendant 7 jours après l'infection par des kystes et les résultats sont présentés sur la figure 3b.Par rapport au groupe traité avec du PBS pur, les résultats ont montré que (i) le poids corporel des souris infectées par le kyste de G. duodenalis a diminué du jour 3 au jour 7 après l'infection ;(ii) le traitement avec l'inhibiteur MCC950 n'a eu aucun effet significatif sur le poids corporel des souris..Par rapport au groupe à infection unique, le poids corporel du groupe à infection duodénale traité avec MCC950 a diminué à des degrés divers (jour 1 : ANOVA, F (3, 24) = 1,885, P = 0,0148 ; Jour 2 : ANOVA, F (3, 24). ) = 0,4602, P<0,0001 ; Jour 3 : ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010 ; Jour 4 : ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052 ; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645 ; jour 6 : ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175 ; jour 7 : ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Ces données démontrent que l'inflammasome NLRP3 protège les souris d'une perte de poids significative dans les premiers stades (2 à 4 jours) de l'infection duodénale.Nous avons ensuite cherché à détecter les trophozoïtes de G. duodenalis dans le liquide de lavage duodénal et les résultats sont présentés à la figure 3c.Comparé au groupe infecté par le kyste de G. duodenalis, le nombre de trophozoïtes dans le duodénum a augmenté de manière significative après le blocage de l'inflammasome NLRP3 (t (12) = 2,902, P = 0,0133).Les tissus duodénaux colorés avec HE ont montré, par rapport au contrôle négatif traité avec du PBS et du MCC950 seuls : (i) L'infection par le kyste de G. duodenalis a entraîné des dommages aux villosités duodénales (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) et atrophie des cryptes (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089) ;(ii) duodénum de souris infectées par des kystes de G. duodenalis et traitées avec des inhibiteurs de MCC950.les villosités duodénales étaient endommagées et mortes (ANOVA, F (3, 24) = 0, 4903, P = 0, 0144) avec atrophie et ramification des cryptes (ANOVA, F (3, 24) = 0, 4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- F) .Ces résultats suggèrent que l'inflammasome NLRP3 joue un rôle dans la réduction du pouvoir pathogène de G. duodenalis.
Rôle de l'inflammasome NLRP3 dans l'infection à Giardia duodenum.Les souris ont été gavées (iv) avec des kystes duodénococciques puis traitées avec ou sans MCC950 (ip).Des groupes de traitement uniques avec PBS ou MCC950 ont été utilisés comme témoins.Groupe expérimental et schéma thérapeutique.b Le poids corporel des souris dans chacun des différents groupes de traitement a été surveillé pendant 7 jours.La différence entre le groupe infecté par G. duodenalis et le groupe de traitement par l'infection par G. duodenalis + MCC950 a été analysée par test t à l'aide du logiciel SPSS version 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives à * P <0,05, ** P <0,01 ou *** P <0,001.c La charge parasitaire a été déterminée en comptant le nombre de trophozoïtes dans le liquide de lavage duodénal.La différence entre le groupe infecté par G. duodenalis et le groupe de traitement par l'infection par G. duodenalis + MCC950 a été analysée par test t à l'aide du logiciel SPSS version 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives à *P < 0,05.d Résultats de la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) de l'histopathologie duodénale.Les flèches rouges indiquent des dommages aux villosités, les flèches vertes indiquent des dommages aux cryptes.Barre d'échelle : 100 µm.e, f Analyse statistique de la hauteur des villosités duodénales et de la hauteur des cryptes de souris.Les astérisques indiquent des différences significatives à * P <0,05 et ** P <0,01.Les résultats sont issus de 7 expériences biologiques indépendantes.PC, poids corporel ;ig, voie d'accouchement intragastrique ;ip, voie d'administration intrapéritonéale ;ns, non significatif (P > 0,05) ;PBS, solution saline tamponnée au phosphate ;WT, type sauvage
La sécrétion d’IL-1β est une caractéristique de l’activation de l’inflammation.Pour déterminer si G. duodenalis alpha-2 giardine et alpha-7.3 giardine activent l'inflammasome hôte NLRP3 in vivo, nous avons utilisé des souris WT non traitées (groupe fictif) et des souris bloquées par l'inflammasome NLRP3 (groupe de traitement inhibé par MCC950).Un schéma détaillé de l'expérience est présenté sur la figure 4a.Les groupes expérimentaux étaient constitués de souris traitées avec du PBS, du traitement du kyste de G. duodenalis par gavage, de l'injection intramusculaire de pcDNA3.1 et de l'injection intramusculaire de pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ou de pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Le 7ème jour après l'administration intramusculaire du plasmide recombinant, le sérum a été collecté et le niveau d'IL-1β dans chaque groupe a été déterminé.Comme le montre la figure 4b, dans le groupe MOCK : (i) par rapport au groupe PBS, le traitement pcDNA3.1 n'a eu aucun effet significatif sur la sécrétion d'IL-1β (ANOVA, F (4,29) = 4,062, P = 0,9998), cependant, La sécrétion d'IL-β était significativement élevée dans le groupe de kystes de G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4, 062, P = 0, 0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine et pcDNA3.1- L'injection intramusculaire d'alpha-7.3 giardine a augmenté de manière significative les taux sériques d'IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001) ;(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine a induit des niveaux élevés de sécrétion d'IL -1β dans le groupe d'injection intramusculaire pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F (4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Par rapport à chaque groupe du groupe de traitement MCC950 et du groupe MOCK : (i) les niveaux de sécrétion d'IL-1β dans le groupe témoin PBS et le groupe témoin pcDNA3.1 ont diminué dans une certaine mesure après le blocage de l'inhibiteur MCC950, mais la différence n'était pas significatif (PBS : ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1 : ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949) ;(ii) après avoir bloqué MCC950., la sécrétion d'IL-1β était significativement réduite dans le groupe infecté par un kyste de G. duodenalis, le groupe pcDNA3.1-alpha-2 giardine et le groupe pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis : ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120 ; pcDNA3.1-alpha-2 giardine : ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 ; ) = 3,540, P = 0,0164).Ces résultats suggèrent que l'alpha-2 giardine et l'alpha-7.3 giardine interviennent dans l'activation de l'inflammasome NLRP3 in vivo.
Les pcDNA3.1(+)-giardines activent l'inflammasome hôte NLRP3 in vivo.Les souris ont été immunisées (IM) avec le plasmide d'expression eucaryote recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ou pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, puis traitées avec MCC950 (ip ; groupe MCC950) ou non (groupe factice ).Le groupe de traitement du plasmide PBS ou pcDNA3.1(+) a été utilisé comme contrôle négatif, le groupe de traitement du kyste de G. duodenalis a été utilisé comme contrôle positif.Groupe expérimental et schéma thérapeutique.b Les taux sériques d'IL-1β chez la souris ont été mesurés au jour 7 par test ELISA.Les différences entre les groupes du groupe MOCK ont été analysées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle, et les différences entre le groupe MOCK et le groupe MCC950 ont été analysées à l'aide du test t du logiciel SPSS version 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives entre les groupes de traitement du groupe MOCK, * P <0,05 et *** P <0,001 ;les signes dollar ($) indiquent des différences significatives entre chaque groupe du groupe MOCK et du groupe MCC950 à P <0,05.Résultats de sept expériences biologiques indépendantes.i, injection intramusculaire, ns, non significatif (P > 0,05)
Pour étudier l'effet de l'activation médiée par l'alpha-2 et l'alpha-7.3 giardine de l'inflammasome hôte NLRP3 sur l'infectiosité de G. duodenalis, nous avons utilisé des souris WT C57BL/6 et injecté de l'alpha-2 giardine et de l'alpha-7.3 giardine.le plasmide a été injecté par voie intramusculaire, après 3 jours, à travers la sonde gastrique du kyste de G. duodenalis, après quoi les souris ont été observées pendant 7 jours.Un schéma détaillé de l'expérience est présenté sur la figure 5a.Le poids corporel de chaque souris a été mesuré chaque jour, des échantillons de tissu duodénal frais ont été prélevés le 7ème jour après l'administration par sonde gastrique, le nombre de trophozoïtes a été mesuré et des changements histopathologiques ont été observés.Comme le montre la figure 5b, avec l'augmentation du temps d'alimentation, le poids corporel des souris de chaque groupe a progressivement augmenté.La MT des souris a commencé à diminuer le 3ème jour après l'administration intragastrique de kystes de G. duodenalis, puis a augmenté progressivement.L'activation de l'inflammasome NLRP3 induite par l'injection intramusculaire d'alpha-2 giardine et d'alpha7.3 giardine a atténué de manière significative la perte de poids chez la souris (jour 1 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Jour 1 : pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Jour 2 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 ; Jour 2 : pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 ; Jour 3 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F ( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Jour 3 : pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Jour 4 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA ; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, jour 4 : pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, jour 5 : pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Jour 5 : pcDNA3.1-alpha -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Jour 6 : pcDNA3 .1 - alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, jour 6 : pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006 ;Jour 7 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Jour 7 : pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).La charge parasitaire a été évaluée dans le duodénum (Fig. 5c).Comparé au contrôle positif non traité et au groupe injecté avec le vecteur pcDNA3.1 vide, le nombre de trophozoïtes de G. duodenalis était significativement réduit dans les groupes injectés avec l'α-2 giardine et l'α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).De plus, la giardine alfa-7.3 était plus protectrice chez la souris que la giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Les résultats de la coloration HE sont présentés sur la fig.5d–f.Les souris ayant reçu une injection d'alpha-2 giardine et d'alpha-7.3 giardine présentaient moins de lésions du tissu duodénal, se manifestant par des lésions des villosités, par rapport aux souris ayant reçu une injection de G. duodenalis et aux souris ayant reçu une injection de G. duodenalis en combinaison avec un vecteur pcDNA3 vide .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 ou P = 0,0068 ; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 ou P = 0,0055) et atrophie réduite des cryptes (pcDNA3.1-alpha-2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 ou P = 0,0158 ; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine : ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ou P = 0,0191).Ces résultats suggèrent que l'alpha-2 giardine et l'alpha-7,3 giardine réduisent le pouvoir infectieux de G. duodenalis en activant l'inflammasome NLRP3 in vivo.
Rôle des pcDNA3.1(+)-giardines dans l'infection à G. duodenalis.Les souris ont été immunisées (IM) avec les plasmides d'expression eucaryotes recombinants pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ou pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, puis confrontées à des kystes de G. duodenalis (ig).Le groupe PBS et le groupe de traitement du kyste duodénal pcDNA3.1(+) + ont été utilisés comme groupes témoins négatifs, et le groupe de traitement du kyste duodénal a été utilisé comme groupe témoin positif.Groupe expérimental et schéma thérapeutique.b La MT des souris dans chacun des différents groupes de traitement a été surveillée pendant 7 jours après la provocation.Les astérisques indiquent des différences significatives entre les groupes du groupe G. duodenalis et du groupe pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001 ;le signe dollar ($) indique une différence significative entre chaque groupe de G. duodenalis et le groupe pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0,01 et $$$P<0,001.c La charge parasitaire a été déterminée en comptant le nombre de trophozoïtes dans 1 ml de lavage duodénal du duodénum (3 cm de long) et exprimée en nombre de parasites par cm de duodénum.Les différences entre le groupe infecté par G. duodenalis, le groupe pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine et le groupe pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ont été analysées par ANOVA unidirectionnelle à l'aide du logiciel SPSS version 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives à ** P <0,01 et *** P <0,001.d Modifications histopathologiques du duodénum.Les flèches rouges indiquent des dommages aux villosités, les flèches vertes indiquent des dommages aux cryptes.Barre d'échelle : 100 µm.e, f Analyse statistique de la hauteur des villosités duodénales de souris (e) et de la hauteur des cryptes (f).Les différences entre les groupes de la figure 1d ont été analysées par ANOVA unidirectionnelle à l'aide du logiciel SPSS version 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives à * P <0,05 et ** P <0,01.Résultats de sept expériences biologiques indépendantes.ns, non significatif (P > 0,05)
Giardia duodenum est un parasite intestinal bien connu des humains et d'autres mammifères qui cause la giardiase.En 2004, elle a été incluse dans l'Initiative de l'OMS sur les maladies négligées en raison de sa forte prévalence sur 6 ans, en particulier dans les communautés à faible statut socio-économique [32].Le système immunitaire inné joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire à l’infection par G. duodenalis.Il a été rapporté que les macrophages de souris engloutissent et tuent G. duodenalis en libérant des pièges extracellulaires (33).Nos études précédentes ont montré que G. duodenalis, un parasite extracellulaire non invasif, active les voies de signalisation inflammatoires p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 et NLRP3 dans les macrophages de souris pour réguler les réponses inflammatoires de l'hôte, et que le GEV libéré peut améliorer ce processus.13], 24].Cependant, les PAMP exacts impliqués dans l’inflammation régulée par l’inflammasome NLRP3 dans le GEV et le rôle de l’inflammasome NLRP3 dans la giardiase restent à élucider.C’est pour éclairer ces deux questions que nous avons mené cette étude.
L'inflammasome NLRP3 est situé dans le cytoplasme des cellules immunitaires et peut être activé par diverses particules telles que des cristaux d'acide urique, des toxines, des bactéries, des virus et des parasites.Dans les études bactériennes, les toxines ont été identifiées comme des PAMP clés qui activent les capteurs inflammatoires, conduisant à l’inflammation et à la mort cellulaire (34).Certaines toxines structurellement diverses, telles que l'hémolysine de Staphylococcus aureus [35] et Escherichia coli [36], l'hémolysine BL (HBL) de l'entérotoxine (NHE) [37], induisent l'activation de l'inflammation de NLRP3.Des études virales ont montré que les protéines de virulence telles que la protéine de l’enveloppe (E) du SARS-COV-2 [38] et la protéine NS5 du virus Zika [39] sont des PAMP importants reconnus par le récepteur NLRP3.Dans les études sur les parasites, de nombreux parasites auraient été associés à l'activation de l'inflammasome de l'hôte, tels que Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] et Leishmania [42].Les protéines granulaires denses GRA35, GRA42 et GRA43, associées à la virulence de Toxoplasma gondii, sont nécessaires à l'induction de la pyroptose dans les macrophages du rat Lewis (43).De plus, certaines études sur Leishmania se sont concentrées sur des molécules individuelles impliquées dans l'inflammasome NLRP3, telles que le lipophosphoglycane membranaire du parasite (44) ou la métalloprotéase de zinc (45).Parmi la famille de gènes alpha-giardine de type annexine, l’alpha-1 giardine s’est révélée être un candidat vaccin potentiel offrant une protection contre G. duodenalis dans un modèle murin (18).Dans notre étude, nous avons sélectionné les facteurs de virulence alpha-2 et alpha-7,3 de G. duodenalis giardines, qui sont propres à Giardia mais relativement moins signalés.Ces deux gènes cibles ont été clonés dans le vecteur du système d’expression eucaryote pcDNA3.1(+) pour l’analyse de l’activation de l’inflammation.
Dans notre modèle murin, les fragments de caspase clivés servent de marqueurs de l’activation inflammatoire.Lors de la stimulation, NLRP3 interagit avec l'ASC, recrute des procaspases et génère des caspases actives qui clivent la pro-IL-1β et la pro-IL-18 en IL-1β et IL-18 matures, respectivement -18.Les caspases inflammatoires (caspases-1, -4, -5 et -11) sont une famille conservée de cystéine protéases qui sont essentielles à la défense innée et sont impliquées dans l'inflammation et la mort cellulaire programmée [46].La caspase-1 est activée par les inflammasomes canoniques [47], tandis que les caspases-4, -5 et -11 sont clivées lors de la formation d'inflammasomes atypiques [48].Dans cette étude, nous avons utilisé les macrophages péritonéaux de souris comme modèle et avons étudié la caspase-1 clivée par la p20 caspase-1 en tant que marqueur de l'activation de l'inflammation de l'hôte NLRP3 dans des études sur l'infection par G. duodenalis.Les résultats ont montré que de nombreuses alpha-giardines sont responsables de l’activation typique de l’inflammation, ce qui concorde avec la découverte de molécules de virulence clés impliquées dans les bactéries et les virus.Cependant, notre étude n'est qu'un examen préliminaire et il existe d'autres molécules qui peuvent activer des inflammatoires non classiques, car notre étude précédente a trouvé à la fois des inflammatoires classiques et non classiques dans l'infection à G. duodenalis (13).Pour déterminer davantage si la caspase-1 p20 générée est associée à l'inflammasome NLRP3, nous avons transfecté les giardines alpha-2 et alpha-7.3 dans des macrophages péritonéaux de souris afin de déterminer les niveaux d'expression des protéines moléculaires clés et les niveaux d'oligomérisation de l'ASC, confirmant que les deux α-giardines s'activent. inflammasome NLRP3.Nos résultats sont légèrement différents de ceux de Manko-Prykhoda et al., qui ont rapporté que la stimulation des cellules Caco-2 avec les souches G. muris ou E. coli EPEC seules peut augmenter l'intensité de fluorescence de NLRP3, ASC et caspase-1, mais pas de manière significative, tandis que la costimulation de G. muris et E. coli a augmenté les niveaux de trois protéines [49].Cet écart peut être dû à des différences dans la sélection des espèces de Giardia, des lignées cellulaires et des cellules primaires.Nous avons également effectué des tests in vivo en utilisant MCC950 chez des souris femelles WT C57BL/6 âgées de 5 semaines, qui sont plus sensibles à G. duodenalis.MCC950 est un inhibiteur de NLRP3 à petites molécules puissant et sélectif qui bloque l'activation canonique et non canonique de NLRP3 à des concentrations nanomolaires.MCC950 inhibe l'activation de NLRP3 mais n'affecte pas l'activation des voies inflammatoires AIM2, NLRC4 et NLRP1 ou des voies de signalisation du TLR (27).MCC950 bloque l'activation de NLRP3 mais n'inhibe pas l'initiation de NLRP3, l'efflux de K+, l'afflux de Ca2+ ou l'interaction entre NLRP3 et ASC ;au lieu de cela, il inhibe l'activation de l'inflammasome NLRP3 en bloquant l'oligomérisation des ASC (27).Par conséquent, nous avons utilisé le MCC950 dans une étude in vivo pour déterminer le rôle de l'inflammasome NLRP3 après injection de giardine.La caspase-1 p10 activée clive les cytokines pro-inflammatoires pro-IL-1β et pro-IL-18 en IL-1β et IL-18 matures (50).Dans cette étude, les taux sériques d'IL-1β chez les souris traitées à la giardine avec ou sans MCC950 ont été utilisés comme indicateur de l'activation de l'inflammasome NLRP3.Comme prévu, le traitement par MCC950 a réduit de manière significative les taux sériques d’IL-1β.Ces données démontrent clairement que G. duodenalis giardin alfa-2 et giardin alfa-7.3 sont capables d'activer l'inflammasome de souris NLRP3.
Des données importantes accumulées au cours de la dernière décennie ont démontré que l'IL-17A est le principal régulateur de l'immunité contre G. muris, induisant la signalisation de l'IL-17RA, produisant des peptides antimicrobiens et régulant l'activation du complément (51).Cependant, l’infection à Giardia survient plus fréquemment chez les jeunes adultes, et il a été rapporté que l’infection à Giardia chez les jeunes souris n’active pas la réponse IL-17A pour exercer son effet protecteur [52], incitant les chercheurs à rechercher d’autres Giardia immunomodulatrices.mécanismes d’infection par les helminthes.Les auteurs d'une étude récente ont rapporté que G. muris peut activer l'inflammasome NLRP3 par E. coli EPEC, ce qui favorise la production de peptides antimicrobiens et réduit sa capacité d'attachement et le nombre de trophozoïtes dans le tractus intestinal, réduisant ainsi la gravité du côlon. maladies causées par des bacilles [49 ].L'inflammasome NLRP3 est impliqué dans le développement de diverses maladies.Des études ont montré que Pseudomonas aeruginosa déclenche l'autophagie dans les macrophages pour éviter la mort cellulaire, et ce processus dépend de l'activation de l'inflammasome NLRP3 (53).Pour N. caninum, l’activation de l’inflammasome NLRP3 médiée par les espèces réactives de l’oxygène limite sa réplication chez l’hôte, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle (9).Il a été démontré que Paracoccidioides brasiliensis induisait l'activation de l'inflammasome NLRP3 dans les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de souris, entraînant la libération de la cytokine inflammatoire IL-1β, qui joue un rôle essentiel dans la défense de l'hôte (10).Plusieurs espèces de Leishmania, dont L. amazonensis, L. major, L. braziliensis et L. infantum chagasi, activent NLRP3 et la caspase-1 dépendante de l'ASC dans les macrophages, ainsi que l'infection par Leishmania.La réplication parasitaire est améliorée chez les souris déficientes en gène NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et coll.Il a été rapporté que l'infection par Leishmania induisait l'activation de l'inflammasome NLRP3 dans les macrophages, ce qui limite la réplication intracellulaire du parasite.Ainsi, Leishmania peut inhiber l’activation de NLRP3 comme stratégie d’évitement.Dans les études in vivo, l’inflammasome NLRP3 a contribué à l’élimination de Leishmania, mais n’a pas affecté les tissus [54].À l’inverse, dans les études sur les helminthiases, l’activation de l’inflammasome NLRP3 a supprimé l’immunité protectrice de l’hôte contre les helminthiases gastro-intestinales [12].Shigella est l’une des principales bactéries responsables de la diarrhée dans le monde.Ces bactéries peuvent induire la production d’IL-1β via un efflux de K+ médié par le récepteur P2X7, des espèces réactives de l’oxygène, une acidification lysosomale et des dommages mitochondriaux.L'inflammasome NLRP3 régule négativement la phagocytose et l'activité bactéricide des macrophages contre Shigella (55).Des études sur Plasmodium ont montré que les souris déficientes en AIM2, NLRP3 ou caspase-1 infectées par Plasmodium produisent des niveaux élevés d'interféron de type 1 et sont plus résistantes à l'infection par Plasmodium (56).Cependant, le rôle de l’alpha-2 giardine et de l’alpha-7.3 giardine dans l’induction de l’activation pathogène de l’inflammation de NLRP3 chez la souris n’est pas clair.
Dans cette étude, l'inhibition de l'inflammasome NLRP3 par MCC950 a réduit le poids corporel et augmenté le nombre de trophozoïtes dans le liquide de lavage intestinal chez la souris, entraînant des modifications pathologiques plus graves du tissu duodénal.L'alpha-2 giardine et l'alpha-7.3 giardine activent l'inflammasome NLRP3 de la souris hôte, augmentent le poids corporel de la souris, réduisent le nombre de trophozoïtes dans le liquide de lavage intestinal et atténuent les lésions pathologiques duodénales.Ces résultats suggèrent que G. duodenalis peut activer l'inflammasome hôte NLRP3 via l'alpha-2 giardine et l'alpha-7,3 giardine, réduisant ainsi le pouvoir pathogène de G. duodenalis chez la souris.
Collectivement, nos résultats démontrent que les giardines alpha-2 et alpha-7.3 induisent l'activation de l'inflammasome hôte NLRP3 et réduisent le pouvoir infectieux de G. duodenalis chez la souris.Ces molécules constituent donc des cibles prometteuses pour la prévention de la giardiase.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
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