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Les vecteurs génétiques destinés au traitement de la mucoviscidose pulmonaire doivent cibler les voies respiratoires conductrices, car la transduction pulmonaire périphérique n'a aucun effet thérapeutique.L'efficacité de la transduction virale est directement liée au temps de séjour du porteur.Cependant, les fluides d'administration tels que les porteurs de gènes se diffusent naturellement dans les alvéoles lors de l'inhalation, et les particules thérapeutiques de toute forme sont rapidement éliminées par transport mucociliaire.Prolonger le temps de séjour des porteurs de gènes dans les voies respiratoires est important mais difficile à réaliser.Les particules magnétiques conjuguées à un porteur qui peuvent être dirigées vers la surface des voies respiratoires peuvent améliorer le ciblage régional.En raison de problèmes liés à l’imagerie in vivo, le comportement de ces petites particules magnétiques à la surface des voies respiratoires en présence d’un champ magnétique appliqué est mal compris.Le but de cette étude était d'utiliser l'imagerie synchrotron pour visualiser in vivo le mouvement d'une série de particules magnétiques dans la trachée de rats anesthésiés afin d'étudier la dynamique et les modèles de comportement de particules uniques et en vrac in vivo.Nous avons ensuite également évalué si l'administration de particules magnétiques lentivirales en présence d'un champ magnétique augmenterait l'efficacité de la transduction dans la trachée du rat.L'imagerie par rayons X synchrotron montre le comportement des particules magnétiques dans des champs magnétiques stationnaires et en mouvement in vitro et in vivo.Les particules ne peuvent pas être facilement entraînées à la surface des voies respiratoires vivantes à l'aide d'aimants, mais pendant le transport, les dépôts sont concentrés dans le champ de vision, là où le champ magnétique est le plus puissant.L’efficacité de la transduction était également multipliée par six lorsque des particules magnétiques lentivirales étaient délivrées en présence d’un champ magnétique.Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les particules magnétiques lentivirales et les champs magnétiques pourraient constituer des approches précieuses pour améliorer le ciblage des vecteurs génétiques et les niveaux de transduction dans les voies respiratoires conductrices in vivo.
La fibrose kystique (FK) est causée par des variations d'un seul gène appelé régulateur de conductance transmembranaire (CFTR).La protéine CFTR est un canal ionique présent dans de nombreuses cellules épithéliales du corps, y compris les voies respiratoires, un site majeur dans la pathogenèse de la mucoviscidose.Les défauts du CFTR entraînent un transport d’eau anormal, une déshydratation de la surface des voies respiratoires et une diminution de la profondeur de la couche de fluide de surface (ASL) des voies respiratoires.Cela altère également la capacité du système de transport mucociliaire (MCT) à dégager les voies respiratoires des particules et des agents pathogènes inhalés.Notre objectif est de développer une thérapie génique lentivirale (LV) pour délivrer la copie correcte du gène CFTR et améliorer l'ASL, le MCT et la santé pulmonaire, et de continuer à développer de nouvelles technologies capables de mesurer ces paramètres in vivo1.
Les vecteurs LV sont l’un des principaux candidats pour la thérapie génique de la mucoviscidose, principalement parce qu’ils peuvent intégrer de manière permanente le gène thérapeutique dans les cellules basales des voies respiratoires (cellules souches des voies respiratoires).Ceci est important car ils peuvent restaurer une hydratation normale et une clairance du mucus en se différenciant en cellules fonctionnelles de la surface des voies respiratoires, corrigées par des gènes, associées à la mucoviscidose, ce qui entraîne des bénéfices à vie.Les vecteurs VG doivent être dirigés contre les voies respiratoires conductrices, car c'est là que commence l'atteinte pulmonaire dans la FK.L’administration du vecteur plus profondément dans les poumons peut entraîner une transduction alvéolaire, mais celle-ci n’a aucun effet thérapeutique dans la mucoviscidose.Cependant, les fluides tels que les porteurs de gènes migrent naturellement dans les alvéoles lorsqu'ils sont inhalés après l'accouchement3,4 et les particules thérapeutiques sont rapidement expulsées dans la cavité buccale par les MCT.L'efficacité de la transduction du VG est directement liée à la durée pendant laquelle le vecteur reste proche des cellules cibles pour permettre l'absorption cellulaire – « temps de résidence » 5 qui est facilement raccourci par le flux d'air régional typique ainsi que par l'absorption coordonnée du mucus et des particules MCT.Pour la mucoviscidose, la capacité à prolonger le temps de séjour du VG dans les voies respiratoires est importante pour atteindre des niveaux élevés de transduction dans cette zone, mais s'est jusqu'à présent révélée un défi.
Pour surmonter cet obstacle, nous proposons que les particules magnétiques (MP) BT puissent aider de deux manières complémentaires.Premièrement, ils peuvent être guidés par un aimant vers la surface des voies respiratoires pour améliorer le ciblage et aider les particules porteuses de gènes à se trouver dans la bonne zone des voies respiratoires ;et ASL) se déplacent dans la couche cellulaire 6. Les MP sont largement utilisés comme véhicules d'administration de médicaments ciblés lorsqu'ils se lient à des anticorps, des médicaments de chimiothérapie ou d'autres petites molécules qui s'attachent aux membranes cellulaires ou se lient à leurs récepteurs respectifs de la surface cellulaire et s'accumulent sur les sites tumoraux dans présence d'électricité statique.Champs magnétiques pour le traitement du cancer 7. D'autres méthodes « hyperthermiques » visent à tuer les cellules tumorales en chauffant les MP lorsqu'elles sont exposées à des champs magnétiques oscillants.Le principe de la transfection magnétique, dans lequel un champ magnétique est utilisé comme agent de transfection pour améliorer le transfert d'ADN dans les cellules, est couramment utilisé in vitro en utilisant une gamme de vecteurs de gènes non viraux et viraux pour les lignées cellulaires difficiles à transduire. ..L'efficacité de la magnétotransfection LV avec l'administration de LV MP in vitro dans une lignée cellulaire d'épithélium bronchique humain en présence d'un champ magnétique statique a été établie, augmentant l'efficacité de la transduction de 186 fois par rapport au vecteur LV seul.LV MT a également été appliquée à un modèle in vitro de mucoviscidose, dans lequel la transfection magnétique a augmenté la transduction du VG dans les cultures à interface air-liquide d'un facteur 20 en présence d'expectorations de mucoviscidose10.Cependant, la magnétotransfection d'organes in vivo a reçu relativement peu d'attention et n'a été évaluée que dans quelques études animales11,12,13,14,15, en particulier dans les poumons16,17.Cependant, les possibilités de la transfection magnétique dans le traitement pulmonaire de la mucoviscidose sont claires.Tan et coll.(2020) ont déclaré qu’« une étude de validation sur l’administration pulmonaire efficace de nanoparticules magnétiques ouvrira la voie à de futures stratégies d’inhalation de CFTR afin d’améliorer les résultats cliniques chez les patients atteints de mucoviscidose »6.
Le comportement des petites particules magnétiques à la surface des voies respiratoires en présence d’un champ magnétique appliqué est difficile à visualiser et à étudier, et donc mal compris.Dans d'autres études, nous avons développé une méthode d'imagerie à rayons X à contraste de phase basée sur la propagation synchrotron (PB-PCXI) pour l'imagerie non invasive et la quantification des changements infimes in vivo de la profondeur de l'ASL18 et du comportement du MCT19,20 afin de mesurer directement l'hydratation de la surface des canaux gazeux. et est utilisé comme indicateur précoce de l’efficacité du traitement.De plus, notre méthode de notation MCT utilise des particules de 10 à 35 µm de diamètre composées d'alumine ou de verre à indice de réfraction élevé comme marqueurs MCT visibles avec le PB-PCXI21.Les deux méthodes conviennent à l’imagerie d’une gamme de types de particules, y compris les MP.
En raison de leur résolution spatiale et temporelle élevée, nos tests ASL et MCT basés sur PB-PCXI sont bien adaptés pour étudier la dynamique et les modèles comportementaux de particules uniques et en vrac in vivo afin de nous aider à comprendre et à optimiser les méthodes de délivrance de gènes MP.L'approche que nous utilisons ici est basée sur nos études utilisant la ligne de lumière SPring-8 BL20B2, dans lesquelles nous avons visualisé le mouvement du fluide après l'administration d'une dose d'un vecteur factice dans les voies respiratoires nasales et pulmonaires de souris pour aider à expliquer nos modèles d'expression génique hétérogènes observés. dans notre gène.études animales avec une dose porteuse de 3,4 .
Le but de cette étude était d'utiliser le synchrotron PB-PCXI pour visualiser les mouvements in vivo d'une série de MP dans la trachée de rats vivants.Ces études d'imagerie PB-PCXI ont été conçues pour tester la série MP, l'intensité du champ magnétique et l'emplacement afin de déterminer leur effet sur le mouvement des MP.Nous avons supposé qu'un champ magnétique externe aiderait le MF délivré à rester ou à se déplacer vers la zone cible.Ces études nous ont également permis de déterminer des configurations d’aimants qui maximisent la quantité de particules laissées dans la trachée après dépôt.Dans une deuxième série d'études, nous avons cherché à utiliser cette configuration optimale pour démontrer le modèle de transduction résultant de l'administration in vivo de LV-MP dans les voies respiratoires du rat, en partant de l'hypothèse que l'administration de LV-MP dans le contexte du ciblage des voies respiratoires entraînerait en efficacité de transduction BT accrue..
Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles approuvés par l'Université d'Adélaïde (M-2019-060 et M-2020-022) et le comité d'éthique animale du synchrotron SPring-8.Les expériences ont été réalisées conformément aux recommandations d'ARRIVE.
Toutes les images radiographiques ont été prises sur la ligne de lumière BL20XU du synchrotron SPring-8 au Japon en utilisant une configuration similaire à celle décrite précédemment21,22.Brièvement, le caisson expérimental était situé à 245 m de l'anneau de stockage synchrotron.Une distance échantillon-détecteur de 0,6 m est utilisée pour les études d’imagerie de particules et de 0,3 m pour les études d’imagerie in vivo afin de créer des effets de contraste de phase.Un faisceau monochromatique d'une énergie de 25 keV a été utilisé.Les images ont été acquises à l'aide d'un transducteur de rayons X haute résolution (SPring-8 BM3) couplé à un détecteur sCMOS.Le transducteur convertit les rayons X en lumière visible à l'aide d'un scintillateur de 10 µm d'épaisseur (Gd3Al2Ga3O12), qui est ensuite dirigé vers le capteur sCMOS à l'aide d'un objectif de microscope ×10 (NA 0,3).Le détecteur sCMOS était un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japon) avec une taille de réseau de 2 048 × 2 048 pixels et une taille de pixel brute de 6,5 × 6,5 µm.Ce paramètre donne une taille de pixel isotrope effective de 0,51 µm et un champ de vision d'environ 1,1 mm × 1,1 mm.La durée d'exposition de 100 ms a été choisie pour maximiser le rapport signal/bruit des particules magnétiques à l'intérieur et à l'extérieur des voies respiratoires tout en minimisant les artefacts de mouvement provoqués par la respiration.Pour les études in vivo, un obturateur de rayons X rapide a été placé dans le trajet des rayons X pour limiter la dose de rayonnement en bloquant le faisceau de rayons X entre les expositions.
Le support LV n’a été utilisé dans aucune étude d’imagerie SPring-8 PB-PCXI car la chambre d’imagerie BL20XU n’est pas certifiée niveau de biosécurité 2.Au lieu de cela, nous avons sélectionné une gamme de MP bien caractérisés auprès de deux fournisseurs commerciaux couvrant une gamme de tailles, de matériaux, de concentrations de fer et d'applications, d'abord afin de comprendre comment les champs magnétiques affectent le mouvement des MP dans les capillaires en verre, puis dans voies respiratoires vivantes.surface.La taille du MP varie de 0,25 à 18 µm et est constituée de divers matériaux (voir tableau 1), mais la composition de chaque échantillon, y compris la taille des particules magnétiques du MP, est inconnue.Sur la base de nos études MCT approfondies 19, 20, 21, 23, 24, nous nous attendons à ce que des MP allant jusqu'à 5 µm puissent être observées sur la surface des voies respiratoires trachéales, par exemple en soustrayant des images consécutives pour améliorer la visibilité du mouvement des MP.Un seul MP ​​de 0,25 µm est inférieur à la résolution du dispositif d'imagerie, mais le PB-PCXI devrait détecter leur contraste volumétrique et le mouvement du liquide de surface sur lequel ils sont déposés après leur dépôt.
Échantillons pour chaque député du tableau.1 a été préparé dans des capillaires en verre de 20 µl (Drummond Microcaps, PA, USA) d'un diamètre interne de 0,63 mm.Les particules corpusculaires sont disponibles dans l'eau, tandis que les particules CombiMag sont disponibles dans le liquide exclusif du fabricant.Chaque tube est rempli à moitié de liquide (environ 11 µl) et placé sur le porte-échantillon (voir Figure 1).Les capillaires en verre ont été placés respectivement horizontalement sur la platine dans la chambre d'imagerie et positionnés sur les bords du liquide.Un aimant à coque en nickel de 19 mm de diamètre (28 mm de long) composé de terres rares, de néodyme, de fer et de bore (NdFeB) (N35, n° de catalogue LM1652, Jaycar Electronics, Australie) avec une rémanence de 1,17 T a été fixé à un table de transfert séparée pour modifier à distance votre position pendant le rendu.L'imagerie aux rayons X commence lorsque l'aimant est positionné à environ 30 mm au-dessus de l'échantillon et les images sont acquises à 4 images par seconde.Pendant l'imagerie, l'aimant a été rapproché du tube capillaire en verre (à une distance d'environ 1 mm), puis déplacé le long du tube pour évaluer l'effet de l'intensité du champ et de la position.
Une configuration d'imagerie in vitro contenant des échantillons MP dans des capillaires en verre au stade de la traduction de l'échantillon xy.Le trajet du faisceau de rayons X est marqué par une ligne pointillée rouge.
Une fois la visibilité in vitro des MP établie, un sous-ensemble d’entre elles a été testé in vivo sur des rats albinos Wistar femelles de type sauvage (âgés d’environ 12 semaines, environ 200 g).Médétomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japon), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japon) et butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Les rats ont été anesthésiés avec le mélange Pharma (Japon) par injection intrapéritonéale.Après l'anesthésie, ils ont été préparés pour l'imagerie en retirant la fourrure autour de la trachée, en insérant un tube endotrachéal (ET ; canule intraveineuse de 16 Ga, Terumo BCT) et en les immobilisant en décubitus dorsal sur une plaque d'imagerie sur mesure contenant un sac thermique. pour maintenir la température du corps.22. La plaque d'imagerie a ensuite été fixée à la platine d'échantillonnage dans la boîte d'imagerie selon un léger angle pour aligner la trachée horizontalement sur l'image radiologique, comme le montre la figure 2a.
(a) Configuration d'imagerie in vivo dans l'unité d'imagerie SPring-8, trajet du faisceau de rayons X marqué d'une ligne pointillée rouge.(b, c) La localisation de l'aimant trachéal a été réalisée à distance à l'aide de deux caméras IP montées orthogonalement.Sur le côté gauche de l'image à l'écran, vous pouvez voir la boucle métallique maintenant la tête et la canule d'administration installée à l'intérieur du tube ET.
Un système de pousse-seringue télécommandé (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) utilisant une seringue en verre de 100 µl a été connecté à un tube PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) à l'aide d'une aiguille de 30 Ga.Marquez le tube pour vous assurer que l’embout est dans la bonne position dans la trachée lors de l’insertion de la sonde endotrachéale.À l'aide d'une micropompe, le piston de la seringue a été retiré et l'extrémité du tube a été immergée dans l'échantillon MP à délivrer.Le tube d'administration chargé a ensuite été inséré dans le tube endotrachéal, plaçant la pointe à la partie la plus forte de notre champ magnétique appliqué attendu.L'acquisition d'images a été contrôlée à l'aide d'un détecteur de respiration connecté à notre boîtier de synchronisation basé sur Arduino, et tous les signaux (par exemple, température, respiration, ouverture/fermeture de l'obturateur et acquisition d'images) ont été enregistrés à l'aide de Powerlab et LabChart (AD Instruments, Sydney, Australie). 22 Lors de l'imagerie Lorsque le boîtier n'était pas disponible, deux caméras IP (Panasonic BB-SC382) ont été positionnées à environ 90° l'une par rapport à l'autre et utilisées pour contrôler la position de l'aimant par rapport à la trachée pendant l'imagerie (Figure 2b, c).Pour minimiser les artefacts de mouvement, une image par respiration a été acquise pendant le plateau terminal du flux respiratoire.
L'aimant est fixé au deuxième étage, qui peut être situé à distance à l'extérieur du corps d'imagerie.Diverses positions et configurations de l'aimant ont été testées, notamment : placé à un angle d'environ 30° au-dessus de la trachée (les configurations sont illustrées sur les figures 2a et 3a) ;un aimant au-dessus de l'animal et l'autre en dessous, avec les pôles fixés pour l'attraction (Figure 3b)., un aimant au-dessus de l'animal et un en dessous, avec les pôles réglés pour la répulsion (Figure 3c), et un aimant au-dessus et perpendiculaire à la trachée (Figure 3d).Après avoir installé l’animal et l’aimant et chargé le MP testé dans la pompe à seringue, délivrez une dose de 50 µl à un débit de 4 µl/sec lors de l’acquisition des images.L'aimant est ensuite déplacé d'avant en arrière le long ou à travers la trachée tout en continuant à acquérir des images.
Configuration magnétique pour l'imagerie in vivo (a) un aimant au-dessus de la trachée à un angle d'environ 30°, (b) deux aimants configurés pour l'attraction, (c) deux aimants configurés pour la répulsion, (d) un aimant au-dessus et perpendiculairement à la trachée. trachée.L'observateur a regardé de la bouche aux poumons en passant par la trachée et le faisceau de rayons X a traversé le côté gauche du rat et est sorti par le côté droit.L'aimant est déplacé soit le long des voies respiratoires, soit à gauche et à droite au-dessus de la trachée dans la direction du faisceau de rayons X.
Nous avons également cherché à déterminer la visibilité et le comportement des particules dans les voies respiratoires en l'absence de mélange de respiration et de fréquence cardiaque.Par conséquent, à la fin de la période d’imagerie, les animaux ont été euthanasiés sans cruauté en raison d’un surdosage de pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, États-Unis ; ~ 65 mg/kg ip).Certains animaux ont été laissés sur la plateforme d'imagerie et, après l'arrêt de la respiration et du rythme cardiaque, le processus d'imagerie a été répété, ajoutant une dose supplémentaire de MP si aucun MP n'était visible à la surface des voies respiratoires.
Les images résultantes ont été corrigées pour les champs plats et sombres, puis assemblées dans un film (20 images par seconde ; 15 à 25 × vitesse normale en fonction de la fréquence respiratoire) à l'aide d'un script personnalisé écrit dans MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Toutes les études sur l'administration du vecteur du gène LV ont été menées au Centre de recherche sur les animaux de laboratoire de l'Université d'Adélaïde et visaient à utiliser les résultats de l'expérience SPring-8 pour évaluer si l'administration du LV-MP en présence d'un champ magnétique pourrait améliorer le transfert de gène in vivo. .Pour évaluer les effets du MF et du champ magnétique, deux groupes d'animaux ont été traités : un groupe a reçu une injection de LV MF avec placement d'aimant, et l'autre groupe a reçu une injection d'un groupe témoin avec LV MF sans aimant.
Les vecteurs du gène LV ont été générés à l'aide des méthodes décrites précédemment 25, 26.Le vecteur LacZ exprime un gène de bêta-galactosidase nucléaire localisé piloté par le promoteur constitutif du MPSV (LV-LacZ), qui produit un produit de réaction bleu dans les cellules transduites, visible sur les fronts et les sections de tissu pulmonaire.Le titrage a été effectué dans des cultures cellulaires en comptant manuellement le nombre de cellules LacZ-positives à l'aide d'un hémocytomètre pour calculer le titre en TU/ml.Les supports sont cryoconservés à -80°C, décongelés avant utilisation et liés au CombiMag en mélangeant 1:1 et en incubant sur la glace pendant au moins 30 minutes avant la livraison.
Rats Sprague Dawley normaux (n = 3/groupe, ~ 2-3 anesthésiés par voie ip avec un mélange de 0,4 mg/kg de médétomidine (Domitor, Ilium, Australie) et 60 mg/kg de kétamine (Ilium, Australie) à l'âge de 1 mois) ip ) injection et canulation orale non chirurgicale avec une canule intraveineuse de 16 Ga.Pour garantir que le tissu des voies respiratoires trachéales reçoit la transduction du VG, il a été conditionné à l'aide de notre protocole de perturbation mécanique décrit précédemment dans lequel la surface des voies respiratoires trachéales a été frottée axialement avec un panier métallique (N-Circle, extracteur de calculs de nitinol sans pointe NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, États-Unis) 30 p28.Ensuite, environ 10 minutes après la perturbation dans l'enceinte de biosécurité, une administration trachéale de LV-MP a été réalisée.
Le champ magnétique utilisé dans cette expérience a été configuré de manière similaire à une étude aux rayons X in vivo, avec les mêmes aimants maintenus au-dessus de la trachée avec des pinces à stent de distillation (Figure 4).Un volume de 50 µl (2 x 25 µl d'aliquotes) de LV-MP a été administré dans la trachée (n = 3 animaux) à l'aide d'une pipette à embout en gel comme décrit précédemment.Le groupe témoin (n = 3 animaux) a reçu le même LV-MP sans utiliser d'aimant.Une fois la perfusion terminée, la canule est retirée de la sonde endotrachéale et l'animal est extubé.L'aimant reste en place 10 minutes avant d'être retiré.Les rats ont reçu par voie sous-cutanée du méloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australie), suivi d'un retrait de l'anesthésie par injection intrapéritonéale de 1 mg/kg de chlorhydrate d'atipamazole (Antisedan, Zoetis, Australie).Les rats ont été gardés au chaud et observés jusqu'à leur guérison complète de l'anesthésie.
Dispositif d'administration LV-MP dans une enceinte de sécurité biologique.Vous pouvez voir que le manchon Luer-lock gris clair du tube ET dépasse de la bouche et que l'embout de la pipette à gel illustré sur la figure est inséré à travers le tube ET jusqu'à la profondeur souhaitée dans la trachée.
Une semaine après la procédure d'administration de LV-MP, les animaux ont été sacrifiés sans cruauté par inhalation de 100 % de CO2 et l'expression de LacZ a été évaluée à l'aide de notre traitement standard X-gal.Les trois anneaux cartilagineux les plus caudaux ont été retirés pour garantir que tout dommage mécanique ou rétention de liquide dû à la mise en place d'une sonde endotrachéale ne serait pas inclus dans l'analyse.Chaque trachée a été coupée dans le sens de la longueur pour obtenir deux moitiés à analyser et placée dans une coupelle contenant du caoutchouc de silicone (Sylgard, Dow Inc) à l'aide d'une aiguille Minutien (Fine Science Tools) pour visualiser la surface luminale.La distribution et le caractère des cellules transduites ont été confirmés par photographie frontale à l'aide d'un microscope Nikon (SMZ1500) avec un appareil photo DigiLite et le logiciel TCapture (Tucsen Photonics, Chine).Les images ont été acquises avec un grossissement de 20x (y compris le réglage maximum pour toute la largeur de la trachée), avec toute la longueur de la trachée affichée étape par étape, fournissant suffisamment de chevauchement entre chaque image pour permettre aux images d'être « assemblées ».Les images de chaque trachée ont ensuite été combinées en une seule image composite à l'aide de Composite Image Editor version 2.0.3 (Microsoft Research) à l'aide de l'algorithme de mouvement planaire. La zone d'expression de LacZ dans les images composites trachéales de chaque animal a été quantifiée à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment28, en utilisant les paramètres de 0,35 < Teinte < 0,58, Saturation > 0,15 et Valeur < 0,7. La zone d'expression de LacZ dans les images composites trachéales de chaque animal a été quantifiée à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment28, en utilisant les paramètres de 0,35 < Teinte < 0,58, Saturation > 0,15 et Valeur < 0,7. L'expédition de LacZ dans le cadre de l'organisation des activités de transport du bétail a été effectuée de manière cohérente avec l'utilisation d'un système de conduite automatique La saison MATLAB (R2020a, MathWorks), décrite dans la saison 28, utilise une valeur de 0,35 <0,58, une valeur> 0,15 et une valeur <0 ,7. La zone d'expression de LacZ dans les images trachéales composites de chaque animal a été quantifiée à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment28 en utilisant des paramètres de 0,35.0,15 et valeur <0,7.Le logiciel MATLAB R2020a est également disponible pour MathWorks pour LacZ.量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 .................... HANCHE LacZ exprime son expérience dans le cadre de l'utilisation automatique de scénarios MATLAB (R2020a, MathWorks), selon la configuration décrite, avec une valeur de 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 et <0,7 . Les zones d'expression de LacZ sur des images composites de la trachée de chaque animal ont été quantifiées à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment en utilisant les paramètres de 0,35 < teinte < 0,58, saturation > 0,15 et valeur < 0,7.En suivant les contours des tissus dans GIMP v2.10.24, un masque a été créé manuellement pour chaque image composite afin d'identifier la zone tissulaire et d'éviter toute fausse détection en dehors du tissu trachéal.Les zones colorées de toutes les images composites de chaque animal ont été additionnées pour donner la zone colorée totale pour cet animal.La surface peinte a ensuite été divisée par la surface totale du masque pour obtenir une surface normalisée.
Chaque trachée a été incluse dans de la paraffine et sectionnée sur une épaisseur de 5 µm.Les coupes ont été contre-colorées avec du rouge neutre rapide pendant 5 minutes et les images ont été acquises à l'aide d'un microscope Nikon Eclipse E400, d'un appareil photo DS-Fi3 et d'un logiciel de capture d'éléments NIS (version 5.20.00).
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).La signification statistique a été fixée à p ≤ 0,05.La normalité a été testée à l'aide du test de Shapiro-Wilk et les différences de coloration LacZ ont été évaluées à l'aide d'un test t non apparié.
Les six MP décrits dans le tableau 1 ont été examinés par PCXI et la visibilité est décrite dans le tableau 2. Deux MP en polystyrène (MP1 et MP2 ; 18 µm et 0,25 µm, respectivement) n'étaient pas visibles par PCXI, mais les échantillons restants ont pu être identifiés. (des exemples sont présentés dans la figure 5).MP3 et MP4 sont faiblement visibles (10-15 % Fe3O4 ; 0,25 µm et 0,9 µm, respectivement).Même si le MP5 (98 % Fe3O4 ; 0,25 µm) contenait certaines des plus petites particules testées, il était le plus prononcé.Le produit CombiMag MP6 est difficile à distinguer.Dans tous les cas, notre capacité à détecter les MF a été grandement améliorée en déplaçant l’aimant d’avant en arrière parallèlement au capillaire.À mesure que les aimants s'éloignaient du capillaire, les particules étaient retirées en longues chaînes, mais à mesure que les aimants se rapprochaient et que l'intensité du champ magnétique augmentait, les chaînes de particules se raccourcissaient à mesure que les particules migraient vers la surface supérieure du capillaire (voir vidéo supplémentaire S1). : MP4), augmentant la densité des particules en surface.À l'inverse, lorsque l'aimant est retiré du capillaire, l'intensité du champ diminue et les MP se réorganisent en longues chaînes s'étendant depuis la surface supérieure du capillaire (voir vidéo supplémentaire S2 : MP4).Une fois que l’aimant cesse de bouger, les particules continuent de se déplacer pendant un certain temps après avoir atteint la position d’équilibre.À mesure que le MP se rapproche et s’éloigne de la surface supérieure du capillaire, les particules magnétiques ont tendance à attirer les débris à travers le liquide.
La visibilité de MP sous PCXI varie considérablement selon les échantillons.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6.Toutes les images présentées ici ont été prises avec un aimant positionné à environ 10 mm directement au-dessus du capillaire.Les grands cercles apparents sont des bulles d'air emprisonnées dans les capillaires, montrant clairement les contours noirs et blancs de l'image à contraste de phase.La case rouge indique le grossissement qui améliore le contraste.Notez que les diamètres des circuits magnétiques sur toutes les figures ne sont pas à l'échelle et sont environ 100 fois plus grands que ceux indiqués.
Lorsque l'aimant se déplace de gauche à droite le long du capillaire, l'angle de la chaîne MP change pour s'aligner avec l'aimant (voir Figure 6), délimitant ainsi les lignes de champ magnétique.Pour MP3-5, une fois que la corde atteint l’angle seuil, les particules traînent le long de la surface supérieure du capillaire.Cela entraîne souvent le regroupement des députés en groupes plus grands à proximité de l'endroit où le champ magnétique est le plus puissant (voir vidéo supplémentaire S3 : MP5).Ceci est également particulièrement évident lors de l’imagerie proche de l’extrémité du capillaire, ce qui provoque l’agrégation et la concentration du MP à l’interface liquide-air.Les particules du MP6, plus difficiles à distinguer que celles du MP3-5, ne traînaient pas lorsque l'aimant se déplaçait le long du capillaire, mais les cordes MP se dissociaient, laissant les particules visibles (voir vidéo supplémentaire S4 : MP6).Dans certains cas, lorsque le champ magnétique appliqué était réduit en déplaçant l'aimant sur une longue distance du site d'imagerie, tous les MP restants descendaient lentement vers la surface inférieure du tube par gravité, restant dans la chaîne (voir vidéo supplémentaire S5 : MP3) .
L'angle de la corde MP change à mesure que l'aimant se déplace vers la droite au-dessus du capillaire.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6.La case rouge indique le grossissement qui améliore le contraste.Veuillez noter que les vidéos supplémentaires sont à titre informatif car elles révèlent une structure de particule importante et des informations dynamiques qui ne peuvent pas être visualisées dans ces images statiques.
Nos tests ont montré que le déplacement lent de l’aimant le long de la trachée facilite la visualisation du MF dans le contexte d’un mouvement complexe in vivo.Aucun test in vivo n'a été réalisé car les billes de polystyrène (MP1 et MP2) n'étaient pas visibles dans le capillaire.Chacun des quatre MF restants a été testé in vivo avec le grand axe de l'aimant positionné sur la trachée à un angle d'environ 30° par rapport à la verticale (voir figures 2b et 3a), car cela aboutissait à des chaînes MF plus longues et était plus efficace. qu'un aimant..configuration terminée.MP3, MP4 et MP6 n'ont été trouvés dans la trachée d'aucun animal vivant.Lors de la visualisation des voies respiratoires des rats après avoir tué les animaux sans cruauté, les particules sont restées invisibles même lorsqu'un volume supplémentaire a été ajouté à l'aide d'un pousse-seringue.MP5 avait la teneur en oxyde de fer la plus élevée et était la seule particule visible. Il a donc été utilisé pour évaluer et caractériser le comportement du MP in vivo.
Le placement de l'aimant sur la trachée lors de l'insertion du MF a permis de concentrer de nombreux MF, mais pas tous, dans le champ de vision.L’entrée trachéale de particules est mieux observée chez les animaux euthanasiés sans cruauté.Figure 7 et vidéo supplémentaire S6 : MP5 montre une capture magnétique rapide et un alignement des particules à la surface de la trachée ventrale, indiquant que les MP peuvent être ciblées sur les zones souhaitées de la trachée.Lors d'une recherche plus distale le long de la trachée après l'administration de MF, certains MF ont été trouvés plus près de la carène, ce qui indique une intensité de champ magnétique insuffisante pour collecter et retenir tous les MF, car ils ont été délivrés à travers la région d'intensité de champ magnétique maximale lors de l'administration de liquide.processus.Cependant, les concentrations postnatales de MP étaient plus élevées autour de la zone d’image, ce qui suggère que de nombreuses MP restaient dans les régions des voies respiratoires où l’intensité du champ magnétique appliqué était la plus élevée.
Images de (a) avant et (b) après l'administration de MP5 dans la trachée d'un rat récemment euthanasié avec un aimant placé juste au-dessus de la zone d'imagerie.La zone représentée est située entre deux anneaux cartilagineux.Il y a du liquide dans les voies respiratoires avant l'administration du MP.La case rouge indique le grossissement qui améliore le contraste.Ces images sont tirées de la vidéo présentée dans S6 : Vidéo supplémentaire MP5.
Le déplacement de l'aimant le long de la trachée in vivo a entraîné une modification de l'angle de la chaîne MP sur la surface des voies respiratoires, similaire à celle observée dans les capillaires (voir Figure 8 et vidéo supplémentaire S7 : MP5).Cependant, dans notre étude, les MP ne pouvaient pas être traînés à la surface des voies respiratoires vivantes, comme pourraient le faire les capillaires.Dans certains cas, la chaîne MP s'allonge à mesure que l'aimant se déplace de gauche à droite.Fait intéressant, nous avons également constaté que la chaîne de particules modifie la profondeur de la couche superficielle du fluide lorsque l'aimant est déplacé longitudinalement le long de la trachée, et se dilate lorsque l'aimant est déplacé directement au-dessus et que la chaîne de particules tourne vers une position verticale (voir Vidéo supplémentaire S7).: MP5 à 0:09, en bas à droite).Le schéma de mouvement caractéristique changeait lorsque l'aimant était déplacé latéralement sur le dessus de la trachée (c'est-à-dire vers la gauche ou la droite de l'animal, plutôt que le long de la trachée).Les particules étaient encore clairement visibles pendant leur mouvement, mais lorsque l'aimant a été retiré de la trachée, les extrémités des chaînes de particules sont devenues visibles (voir vidéo supplémentaire S8 : MP5, à partir de 0:08).Ceci est en accord avec le comportement observé du champ magnétique sous l'action d'un champ magnétique appliqué dans un capillaire en verre.
Exemples d'images montrant MP5 dans la trachée d'un rat vivant anesthésié.(a) L'aimant est utilisé pour acquérir des images au-dessus et à gauche de la trachée, puis (b) après avoir déplacé l'aimant vers la droite.La case rouge indique le grossissement qui améliore le contraste.Ces images proviennent de la vidéo présentée dans la vidéo supplémentaire du S7 : MP5.
Lorsque les deux pôles étaient accordés dans une orientation nord-sud au-dessus et au-dessous de la trachée (c'est-à-dire en attirant ; Fig. 3b), les cordes MP semblaient plus longues et étaient situées sur la paroi latérale de la trachée plutôt que sur la surface dorsale de la trachée. trachée (voir Annexe).Vidéo S9 : MP5).Cependant, des concentrations élevées de particules sur un site (c'est-à-dire la surface dorsale de la trachée) n'ont pas été détectées après l'administration de liquide à l'aide d'un dispositif à double aimant, ce qui se produit généralement avec un dispositif à un seul aimant.Ensuite, lorsqu’un aimant était configuré pour repousser les pôles opposés (Figure 3c), le nombre de particules visibles dans le champ de vision n’augmentait pas après la livraison.La configuration des deux configurations d'aimants est difficile en raison de l'intensité élevée du champ magnétique qui attire ou pousse respectivement les aimants.La configuration a ensuite été modifiée en un seul aimant parallèle aux voies respiratoires mais traversant les voies respiratoires à un angle de 90 degrés de sorte que les lignes de force traversent orthogonalement la paroi trachéale (Figure 3d), une orientation destinée à déterminer la possibilité d'agrégation de particules sur la paroi latérale.être observé.Cependant, dans cette configuration, il n’y avait aucun mouvement d’accumulation de MF ou mouvement d’aimant identifiable.Sur la base de tous ces résultats, une configuration avec un seul aimant et une orientation à 30 degrés a été choisie pour les études in vivo de porteurs de gènes (Fig. 3a).
Lorsque l'animal a été photographié plusieurs fois immédiatement après avoir été sacrifié sans cruauté, l'absence de mouvement des tissus interférents signifiait que des lignes de particules plus fines et plus courtes pouvaient être discernées dans le champ intercartilagineux clair, « se balançant » conformément au mouvement de translation de l'aimant.voir clairement la présence et le mouvement des particules MP6.
Le titre de LV-LacZ était de 1,8 x 108 UI/mL, et après mélange 1:1 avec CombiMag MP (MP6), les animaux ont reçu une injection de 50 µl d'une dose trachéale de 9 x 107 UI/ml de véhicule LV (soit 4,5 x 106 TU/rat).).).Dans ces études, au lieu de déplacer l'aimant pendant le travail, nous avons fixé l'aimant dans une position pour déterminer si la transduction VG pouvait (a) être améliorée par rapport à l'administration vectorielle en l'absence de champ magnétique, et (b) si les voies respiratoires pouvaient concentre-toi.Les cellules sont transduites dans les zones cibles magnétiques des voies respiratoires supérieures.
La présence d’aimants et l’utilisation de CombiMag en combinaison avec des vecteurs LV ne semblent pas nuire à la santé animale, contrairement à notre protocole standard d’administration de vecteurs LV.Des images frontales de la région trachéale soumise à une perturbation mécanique (Fig. 1 supplémentaire) ont montré que le groupe traité LV-MP présentait des niveaux de transduction significativement plus élevés en présence d'un aimant (Fig. 9a).Seule une petite quantité de coloration bleue LacZ était présente dans le groupe témoin (Figure 9b).La quantification des régions normalisées colorées au X-Gal a montré que l'administration de LV-MP en présence d'un champ magnétique entraînait une amélioration d'environ 6 fois (Fig. 9c).
Exemple d'images composites montrant la transduction trachéale avec LV-MP (a) en présence d'un champ magnétique et (b) en l'absence d'aimant.(c) Amélioration statistiquement significative de la zone normalisée de transduction LacZ dans la trachée avec l'utilisation d'un aimant (*p = 0,029, test t, n = 3 par groupe, moyenne ± erreur type de la moyenne).
Les coupes neutres colorées en rouge rapide (exemple illustré dans la Fig. 2 supplémentaire) indiquaient que les cellules colorées au LacZ étaient présentes dans le même échantillon et au même endroit que celui indiqué précédemment.
Le principal défi de la thérapie génique des voies respiratoires reste la localisation précise des particules porteuses dans les zones d'intérêt et l'obtention d'un niveau élevé d'efficacité de transduction dans le poumon mobile en présence d'un flux d'air et d'une élimination active du mucus.Pour les transporteurs LV destinés au traitement des maladies respiratoires liées à la mucoviscidose, augmenter le temps de séjour des particules porteuses dans les voies respiratoires conductrices était jusqu'à présent un objectif inaccessible.Comme l'ont souligné Castellani et al., l'utilisation de champs magnétiques pour améliorer la transduction présente des avantages par rapport à d'autres méthodes de délivrance de gènes telles que l'électroporation, car elle peut combiner simplicité, économie, délivrance localisée, efficacité accrue et temps d'incubation plus court.et éventuellement une dose plus faible de véhicule10.Cependant, le dépôt et le comportement in vivo de particules magnétiques dans les voies respiratoires sous l’influence de forces magnétiques externes n’ont jamais été décrits et, en fait, la capacité de cette méthode à augmenter les niveaux d’expression génique dans les voies respiratoires vivantes intactes n’a pas été démontrée in vivo.
Nos expériences in vitro sur le synchrotron PCXI ont montré que toutes les particules que nous avons testées, à l'exception du polystyrène MP, étaient visibles dans le dispositif d'imagerie que nous avons utilisé.En présence d'un champ magnétique, les champs magnétiques forment des chaînes dont la longueur est liée au type de particules et à la force du champ magnétique (c'est-à-dire la proximité et le mouvement de l'aimant).Comme le montre la figure 10, les cordes que nous observons se forment lorsque chaque particule individuelle devient magnétisée et induit son propre champ magnétique local.Ces champs séparés provoquent la collecte et la connexion d'autres particules similaires avec des mouvements de cordes de groupe dus aux forces locales provenant des forces locales d'attraction et de répulsion d'autres particules.
Schéma montrant (a, b) des chaînes de particules se formant à l'intérieur de capillaires remplis de liquide et (c, d) une trachée remplie d'air.Notez que les capillaires et la trachée ne sont pas dessinés à l'échelle.Le panneau (a) contient également une description du MF contenant des particules de Fe3O4 disposées en chaînes.
Lorsque l'aimant s'est déplacé sur le capillaire, l'angle de la chaîne de particules a atteint le seuil critique pour le MP3-5 contenant du Fe3O4, après quoi la chaîne de particules n'est plus restée dans sa position d'origine, mais s'est déplacée le long de la surface vers une nouvelle position.aimant.Cet effet se produit probablement parce que la surface du capillaire en verre est suffisamment lisse pour permettre ce mouvement.Il est intéressant de noter que MP6 (CombiMag) ne s'est pas comporté de cette façon, peut-être parce que les particules étaient plus petites, avaient un revêtement ou une charge de surface différente, ou encore parce que le fluide porteur exclusif affectait leur capacité à se déplacer.Le contraste dans l'image des particules CombiMag est également plus faible, ce qui suggère que le liquide et les particules peuvent avoir la même densité et ne peuvent donc pas facilement se rapprocher les uns des autres.Les particules peuvent également rester coincées si l'aimant se déplace trop rapidement, ce qui indique que l'intensité du champ magnétique ne peut pas toujours surmonter la friction entre les particules dans le fluide, ce qui suggère que l'intensité du champ magnétique et la distance entre l'aimant et la zone cible ne doivent pas être considérées comme un facteur déterminant. surprendre.important.Ces résultats indiquent également que même si les aimants peuvent capturer de nombreuses microparticules circulant à travers la zone cible, il est peu probable que l'on puisse compter sur eux pour déplacer les particules CombiMag le long de la surface de la trachée.Ainsi, nous avons conclu que les études in vivo LV MF devraient utiliser des champs magnétiques statiques pour cibler physiquement des zones spécifiques de l'arbre des voies respiratoires.
Une fois que les particules sont introduites dans le corps, elles sont difficiles à identifier dans le contexte du mouvement complexe des tissus du corps, mais leur capacité de détection a été améliorée en déplaçant l'aimant horizontalement au-dessus de la trachée pour « remuer » les cordes MP.Bien que l’imagerie en temps réel soit possible, il est plus facile de discerner le mouvement des particules après que l’animal a été tué sans cruauté.Les concentrations de MP étaient généralement les plus élevées à cet endroit lorsque l'aimant était positionné sur la zone d'imagerie, bien que certaines particules se trouvaient généralement plus loin dans la trachée.Contrairement aux études in vitro, les particules ne peuvent pas être entraînées vers le bas de la trachée par le mouvement d'un aimant.Cette découverte est cohérente avec la façon dont le mucus qui recouvre la surface de la trachée traite généralement les particules inhalées, les emprisonnant dans le mucus et les éliminant ensuite par le mécanisme de clairance muco-ciliaire.
Nous avons émis l'hypothèse que l'utilisation d'aimants au-dessus et au-dessous de la trachée pour l'attraction (Fig. 3b) pourrait entraîner un champ magnétique plus uniforme, plutôt qu'un champ magnétique hautement concentré en un point, ce qui pourrait entraîner une distribution plus uniforme des particules..Cependant, notre étude préliminaire n’a pas trouvé de preuves claires pour étayer cette hypothèse.De même, le réglage d'une paire d'aimants pour repousser (Fig. 3c) n'a pas entraîné de dépôt supplémentaire de particules dans la zone d'image.Ces deux résultats démontrent que la configuration à double aimant n’améliore pas de manière significative le contrôle local du pointage MP et que les fortes forces magnétiques qui en résultent sont difficiles à régler, ce qui rend cette approche moins pratique.De même, l’orientation de l’aimant au-dessus et à travers la trachée (Figure 3d) n’a pas non plus augmenté le nombre de particules restant dans la zone imagée.Certaines de ces configurations alternatives peuvent ne pas réussir car elles entraînent une réduction de l’intensité du champ magnétique dans la zone de dépôt.Ainsi, la configuration d’un seul aimant à 30 degrés (Fig. 3a) est considérée comme la méthode de test in vivo la plus simple et la plus efficace.
L'étude LV-MP a montré que lorsque les vecteurs LV étaient combinés avec CombiMag et administrés après avoir été physiquement perturbés en présence d'un champ magnétique, les niveaux de transduction augmentaient de manière significative dans la trachée par rapport aux témoins.Sur la base d'études d'imagerie synchrotron et des résultats de LacZ, le champ magnétique semble pouvoir maintenir le LV dans la trachée et réduire le nombre de particules vectorielles qui pénètrent immédiatement profondément dans les poumons.De telles améliorations du ciblage peuvent conduire à une plus grande efficacité tout en réduisant les titres délivrés, la transduction non ciblée, les effets secondaires inflammatoires et immunitaires et les coûts de transfert de gènes.Surtout, selon le fabricant, CombiMag peut être utilisé en combinaison avec d’autres méthodes de transfert de gènes, notamment d’autres vecteurs viraux (tels que l’AAV) et des acides nucléiques.